LYM基因克隆构建PAbAi载体.docVIP

= 1 \* ROMAN I 加样 酶(HS) 0.5ul 前引物 1ul 后引物 1ul HS(25) dNTP (2.5mM) 1ul 30s/1Kb buffer 5 DNA 1ul 灭菌水 16.5 ul 加完样后短暂离心后需将产物置于冰上数分钟后再放进PCR仪；点样时加5ul的marker，根据marker亮度来估算产物浓度。 II 目的片段回收，依据试剂盒说明书。最后一步用加热过的ddH2O溶解 III 回收的目的片段连接BD载体 1.1含pAbAi载体的质粒提取：将-80℃保存的菌液划线（AD、pAbAi涂氨苄抗性的板，BD涂卡那抗性的板），37℃培养14-16h,挑取单菌落摇菌，然后按照质粒提取试剂盒提取质粒即可，将提取的质粒置于-20℃保存。（这里的质粒可以通俗的理解为载体） 1.2对连接启动子的做单杂的载体pAbAi进行双酶切，用的是SalI和SacI, 37度酶切3个小时 Sac I 1uL Sal I 1uL 10*T buffer BSA 3uL 2ul pAbAi 1ug H2O Up to 20ul 20ul 1.3将双酶切产物全部跑胶，检测是否双酶切成功并回收 重点：将8管成功双酶切产物跑的胶收集到一个离心管里回收，目的是提高双酶切产物的浓度(大约30ng/ul即可用)，记得需要点未双酶切的质粒作为对照； 回收后要跑胶检测浓度：1ul双酶切产物+1ulLoading Buffer跑胶，并且15000的Marker点5ul，根据条带亮度来判断双酶切产物浓度，条带大约7.3kp大小。 双酶切产物一般-20℃放置3个月以后连接效率就降低了，所以双酶切的量要酌情控制。 如果已经有双酶切好的PAbAi载体，则不需要再做1.1-1.3的内容，直接进行1.4的操 1.4将PCR扩增成功的目的基因割胶回收后用试剂盒直接连到PAbAi载体上。 连接体系为：（37℃,30min, 也可以过夜） 双酶切的PAbAi Exnase 1ul 1ul 5×CE II Buffer 2ul 插入片段扩增产物 2-6ul H2O Up to 10ul 10ul体系 图二、从左向右根据条带亮度插入片段扩增产物依次加4ul、6ul、2ul即可。 III 连接产物转化大肠杆菌 a 将一半的连接产物（5ul）加到感受态细胞中（1.5ml离心管），冰上放置30min b 42℃水浴90s(切勿超过90s),迅速放回冰上放置2min以上 c 加入纯的LB液体培养基1ml（或者SOC培养液500ml），培养箱37℃、200rpm震荡1h（这里的时间是不定的，只要菌摇浑浊即可） d 4000rpm离心1min后，倒掉部分上清液，留一部分上清液，涡旋混匀。然后涂布到预先制好的LB固体培养基（含氨苄），37℃过夜培养 注意事项： 感受态细胞脆弱，加样时需要放置冰上，并且直接加至离心管底，新拿出的感受态需要分装5管，以免反复冻融失效。 = 4 \* ROMAN IV 菌液PCR a 挑菌斑：超净工作台上用镊子夹取灭菌白枪头，蘸长出的菌斑，一般挑8个斑，放至加有40ul含氨苄的LB液体培养基中，37℃、200rpm震荡1h至菌液浑浊 b 菌液PCR （10ul体系） rtaq (premix) 5ul 上游引物（通用引物或者目的片段引物）0.25ul 下游引物（通用引物或者目的片段引物）0.25ul 灭菌水 4ul 菌液 0.5ul Tips: 加0.5ul菌液时直接用挑菌斑时放在离心管中的白枪头即可。 PCR经验退火温度为58℃。 V 送测 将有阳性克隆的40ul菌液（IV a步骤中得到的菌液）超净工作台上分装至两个灭菌1.5ul离心管，并各加1ml含kana的LB液体培养基，37℃、200rpm震荡至菌液浑浊后，一管送测，另一管4℃保存至测序结果出来。（也可以要求测序公司返还菌液和质粒） = 6 \* ROMAN VI 菌液保存 a 大肠杆菌菌液需加总浓度20-30%的甘油，封口膜封口标记后-80℃保存。 E.g. 500ul菌液+250ul 75%甘油 （超净工作台进行）