实验六植物组织基因组DNA的提取和分析CTAB法.pptVIP

实验六植物组织基因组DNA的提取和分析CTAB法 2 （1）掌握植物组织中DNA提取的原理和方法。 （2）掌握DNA的琼脂糖凝胶电泳检测方法 一、实验目的 二、实验原理 通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。 CTAB, SDS等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。 二、实验原理 再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。 上清液中加入异丙醇或乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于双蒸水或TE溶液中，即得植物总DNA溶液。 之后可加入RNA酶降解其中的RNA，再用氯仿除去RNA酶，得到较纯的DNA制剂。 CTAB法流程图： 6 三、仪器和试剂 1、仪器： 恒温水浴锅、高速离心机、水平电泳槽、电泳仪。 2、试剂： 液氮、CTAB提取缓冲液、氯仿:异戊醇（24:1）、异丙醇、70%乙醇、TE缓冲液、上样缓冲液（0.5%溴酚蓝+40%蔗糖）、1×TAE电泳缓冲液。 四、实验步骤 1、DNA的提取 8 四、实验步骤 2、DNA电泳检测 （1）1%琼脂糖凝胶：称取0.3g琼脂糖，加入30mL 1×TAE缓冲液，在微波炉中加热，反复加热、振荡2-3次，使琼脂糖充分融化。待凝胶冷却至60℃左右，倒入插入梳子的凝胶板中（避免产生气泡），让凝胶自然凝固。 （2）待凝胶凝固后，小心拔出梳子，避免前后左右摇晃，以免破坏胶面及加样孔，小心将凝胶和胶床放入电泳槽中，加样孔靠近阴极的一端。 9 四、实验步骤 2、DNA电泳检测 （3）上样电泳：将20μLDNA样品溶液和5μL上样缓冲液混匀后，上样，100V稳压电泳检查，根据指示剂迁移的位置，判断是否中止电泳。切断电源后，再取出凝胶。 （4）照胶、拍照：将凝胶泡在EB溶液（注意：EB溶液为剧毒物，需带上一次性手套拿取凝胶）中10min左右，进入暗室，使用凝胶成像系统照胶并拍照。 10 五、实验结果与分析 将凝胶图片打印出来，需要说明： 1、小组点样孔号； 2、DNA质量分析。 六、注意事项 （1）叶片磨得越细越好。 （2）移液器的使用。 （3）由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步（研磨）的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。 12 1、在DNA抽提过程中造成DNA分子断裂的主要因素有哪些？ 2、本实验中所用到下列试剂（CTAB、氯仿、异丙醇、75%乙醇）的作用各是什么? 七、思考题