血清学检查资料.doc

血清学检查 B.1间接红细胞凝集试验（IHA） B.1.1抗原：为用葡聚糖凝胶G100初步纯化的SEA致敏的绵羊红细胞。所用绵羊红细胞先经2.5%戊二醛化及1：5000鞣酸溶液鞣化后再行致敏。致敏后的红细胞以含10%蔗糖及1%正常兔血清的PH7.2PBS配5%悬液，分装安瓿低压冻干封存。每批致敏红细胞作效价测定，滴度达1：1280～1：2560为合格。抗原也可采用SEA和AUA的混合抗原；血球也可采用人“O”型红细胞。 B.1.2操作方法 B.1.2.1启开安瓿，每支以1ml蒸馏水稀释混匀备用。 B.1.2.2用微量滴管加4滴（0.025ml/滴）生理盐水于微量血凝反应板第一排第二孔内，第三孔空白，第四孔加1滴。 B.1.2.3第一孔内储存待检血清，并从中吸取血清1滴加入第二孔内，充分混匀后，吸出两滴于第三孔和第四孔各加1滴。在第四孔混匀后弃去1滴使第三孔、第四孔血清稀释度为1：5，1：10。 B.1.2.4用定量吸管吸取致敏红细胞悬液，于第三孔和第四孔内各加1滴，立即旋转震摇2min,室温下静置1h左右，观察结果。 B.1.2.5每次试验均应有阳性血清作阳性对照，生理盐水作阴性对照。 B.1.3结果判断 B.1.3.1阴性反应为红细胞全部沉入孔底，肉眼见一边缘光滑，致密的小圆点。 B.1.3.2阳性反应： ＋＋＋＋?红细胞形成薄层凝集，边缘呈现不规则的皱褶。 ＋＋＋?红细胞形成薄层凝集，充满整个孔底。 ＋＋?红细胞形成薄层凝集，面积较“＋＋＋”者小。 ＋?红细胞大部分沉集于孔底，形成一圆点，周围有少量凝集的红细胞，肉眼见周边模糊（或中间出现较为明显的空白点）。 B.1.4反应标准：以血清1：10稀释出现凝集反应可判为阳性。 B.2?酶联免疫吸附试验（ELISA） B.2.1抗原或抗体：常用SEA包被载体检测抗体，亦可用单克隆抗体包被载体以检测抗原。 B.2.2操作方法 B.2.2.1于微量聚苯乙烯或聚氯乙烯塑料板的凹孔中加入100μl以PH9.6碳酸盐缓冲液稀释的SEA或单克隆抗体，置4℃过夜。 B.2.2.2次日倾去抗原，用含有0.05%吐温－20的磷酸缓冲盐水（PBS-T PH7.4，0.01mol/L）洗涤3次，每次5 min。 B.2.2.3于凹孔中加入以PBS-T作1：100或? 1：200稀释的受检者血清及参考血清（每批设1个阴性对照和1个阳性对照）100μl，37℃，1h。 B.2.2.4倾去血清，以PBS-T洗涤3次，每次5 min。 B.2.2.5加入以PBS-T作1：1000或? 1：4000稀释的辣根过氧化物酶（HRP）-标记结合物100μl，37℃，1h。 B.2.2.6倾去酶标记结合物，以PBS-T洗涤3次，每次5 min。 B.2.2.7加入100μl已加H2O2的邻苯二胺（OPD）或四甲基联苯胺（TMB）底物溶液，37℃，30min。 B.2.2.8在各凹孔中加入2mol/L硫酸（H2SO4）50μl以终止反应。 B.2.2.9在酶标专用比色计上读取492nm（OPD为底物）或450 nm（TMB为底物）光密度（OD）值，以P/N≥2.1倍判为阳性。 B.3胶体染料试纸条法试验（DDIA） B.3.1抗原：胶体染料标记的血吸虫SEA。 B.3.2操作方法 B.3.2.1轻轻混匀抗原贮存管中胶体染料标记的抗原液。 B.3.2.2加50μl标记液至PVC小杯中，再入10μl待检血清，缓缓混匀1min。 B.3.2.3取试纸条插入小杯中，约10min左右，待对照带区出现紫蓝色反应带，即可判断结果。 B.3.3结果判断 以检测带区和对照带区均出现紫蓝色反应带为阳性；以对照带出现紫蓝色反应带，而检测带区无反应为阴性。 B.4环卵沉淀试验（COPT） B.4.1虫卵：热处理超声干燥虫卵粉。以重感染兔血清（接种尾蚴1500～2000条，42 d的兔血清）测试环沉率＞30%为合格。 B.4.2操作方法：先用熔化的石蜡在洁净的载玻片两端分别划两条相距20mm的蜡线，在蜡线之间加受检者血清2滴（0.05 ml～0.10 ml），然后用针头挑取干卵约100个～150个，加入血清中，混匀，覆以24mm×24mm盖玻片，四周用石蜡密封后，置于37℃温箱中，经48h～72h后用低倍（80×～100×）显微镜观察反应结果，疑似者应在高倍（400×）显微镜下加以识别。 为简化操作亦可选用预制的有双圆孔的双面胶纸条，只需在圆孔中加入干卵和50μl血清，覆以盖玻片，置37℃孵箱中48h，观察结果。或选用预制干卵PVC膜片，只需加入血清，置湿盒中37℃保温经24h取出，倾去血清，加少量盐水显微镜下观察反应。 B.4.3反应标准：典型的阳性反应虫卵周围有泡状、指状或细长卷曲的带状沉淀物，边缘较整齐，有明显的折光。其中泡状沉淀物须大于1