核酸的分离纯化及鉴定技术生化分析描述.pptVIP

第七章 核酸的分离纯化及鉴定技术;提取核酸的目的:;主要核酸类药物及用途 ;主要核酸类药物及用途; DNA ：主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA（cpDNA），质粒DNA。 RNA：主要存在于细胞质中，如mRNA，rRNA，tRNA，miRNA等。 除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。;一、 材料与方法的选择 ; 根据具体生物材料的性质与起始量、待分离核酸的性质与用途而采取不同的方案。 无论采取何种方法，都应遵循总的原则： 保证核酸一级结构的完整性， 尽量排除其它分子的污染，保证核酸样品的纯度。 ;核酸制备时应注意的事项: ①尽量简化操作步骤，缩短提取过程。 ②减少化学因素对核酸的降解(pH4-10) ③减少物理因素对核酸的降解,如机械剪 切力和高温 ④防止核酸的生物降解。 ;核酸制备的步骤： ; 破碎细胞 微生物：溶菌酶、SDS裂解。 高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。 动物：液氮处理后用匀浆器破碎。 细胞器DNA，首先纯化细胞器。 以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂 ;DNA酶抑制剂： 金属离子螯合剂：DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。如：EDTA 阴离子表面活性剂：如SDS。该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。 RNA酶抑制剂： 皂土：带负电荷，能吸附RNase，使其失活。 DEPC(焦碳酸二乙酯 )：通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。 ;(二) 核酸的分离与纯化; 1.? DNA分离纯化过程 破碎细胞 + DNA抽提液(EDTA、去污剂、蛋白酶K) 65℃温育20’ 冰浴冷却 离心去细胞碎片 上清液 用水饱和苯酚抽提2~3次 上层液相用氯仿抽至界面无蛋白变性物 上层液相用两倍体积冷乙醇沉淀 沉淀物用70%冷乙醇洗涤,干燥 溶于缓冲液 加入RNase处理除去RNA 苯酚氯仿抽提 沉淀干燥 ; EDTA：破坏细胞膜，螯合Mg2+、Ca2+，使DNase失活； SDS：可破坏细胞膜、抑制核酸酶，还可使核酸从蛋白质上游离下来； 蛋白酶K：非特异性蛋白酶，可将蛋白质消化成氨基酸； 65℃：高温下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸； 冰浴：降低温度使蛋白质及多糖杂质沉淀；;水饱和苯酚：由于蛋白与DNA连结键已断裂，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，DNA溶于水相。苯酚使蛋白质变性，并抑制了DNase的降解作用。 氯仿：氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，还能去除植物色素和蔗糖。 异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相、下层有机溶剂相维持稳定。 无水乙醇沉淀DNA：与核酸不发生任何化学反应；对盐类沉淀少，沉淀中所含微量乙醇易挥发除去。 ;2.? RNA分离纯化----Trizol一步法; 所有的组织中均存在RNA酶，人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小时以上。凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理，再用蒸馏水冲净。 DEPC：焦碳酸二乙酯，是一种强烈但并不彻底的RNA酶抑制剂，通过和RNA酶中His结合使蛋白质变性，抑制RNA酶活性。;利用乙醇的易挥发性洗掉异丙醇,氯仿； 溶解一些沉淀中可能的有机物杂质; (三) 核酸的浓缩;三 鉴定与保存 ;1．浓度鉴定; (2) 荧光光度法; (1)紫外分光光度法：紫外分光光度法主 要通过A260与A280的比值来判定有无蛋白 质的污染。在TE缓冲液中，纯DNA的A260 ／A280比值为1.8 ，纯RNA的A260／A280比 值为2.