DNA基本技术课件.pptVIP

* 第一节 核酸印迹技术与分子杂交 Nucleic Acid Blotting and Molecular Hybridization 什么是核酸分子杂交 核酸分子杂交（nucleotide molecular hybridization） 以DNA的变性、复性为理论基础 指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经过复性处理后，形成异源双链的过程 一、Southern 印迹可用于分析基因拷贝数的变化 由E. M. Southern在1975年提出 可用于分析基因拷贝数的变化 基本操作过程包括 待测DNA样品的制备和基因探针的标记； 待测DNA样品的电泳分离； 电泳分离的DNA经变性、转移、固定到合适的固相支持物； 特异性核酸探针与膜上DNA片段杂交，放射自显影或显色检测目的DNA的存在。 Southern印迹分析基本流程 滤纸 NC膜 凝胶 滤纸 电泳 转移 杂交，显影 酶切DNA样品上样 DNA印迹 重物 缓冲液 二、Northern 印迹和RT-PCR可用于分析基因转录水平的变化 Northern blot是将RNA从凝胶中转印到硝酸纤维素膜上，定性分析mRNA的常用方法； RT-PCR是以mRNA为模板反转录合成cDNA、再以cDNA为模板进行特异性扩增，进行RNA定性或定量分析的一种方法； 二者均可用于分析基因转录水平的变化 。 三、原位分子杂交技术可用于基因及其表达产物的定位分析 原位杂交（in situ hybridization，ISH）即利用分子杂交技术来进行基因及其表达产物定位分析的一种技术； 可用于基因及其表达产物的定位分析。 * FISH 箭头所示为杂交信号，结合带型分析可判断染色体位置 第二节 聚合酶链式反应 Polymerase Chain Reaction 什么是聚合酶链式反应 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR） 是一种在体外特异地扩增已知基因的方法； 由K. Mullis于1983年建立； 可用于分析基因及其产物的水平变化； 可进行实时、定量分析； 可结合免疫沉淀的方法确定蛋白质与DNA序列的相互作用。 PCR技术的工作原理 5` 3` 3` 5` 5` 3` 3` 5` + + 5` 5` 变性、退火 引物 5` 3` 3` 5` + 5` 5` dNTPs Taq DNA聚合酶 不同长度新链DNA 循环1 + 引物 变性、退火 25～30 次循环后，模板DNA得到扩增 5` 3` 3` 5` + 5` 3` 3` 5` + + 5` 3` 3` 5` + 5` 3` 3` 5` + + dNTP Taq DNA 聚合酶 均一长度新链DNA 循环2 一、PCR技术分析基因及其产物 反转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）是将RNA的反转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。 RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分析的最有效方法。 mRNA 5? AAAAAA(n) 3? mRNA 5? AAAAAA(n) 3? TTTTTT(n) 5? mRNA 5? cDNA 3? AAAAAA(n) 3? TTTTTT(n) 5? AAAAAA(n) 3? TTTTTT(n) 5? oligo(dT)12-18 反转录酶 RNase H DNA 聚合酶 S1 核酸酶 3? cDNA TTTTTT(n) 5? AAAAAA(n) 3? TTTTTT(n) 5? 反转录合成cDNA 二、PCR技术可以进行实时、定量分析 Q R 3 3 5 5 上游引物 下游引物 荧光标记引物 R Q 3 3 5 5 三、PCR结合免疫沉淀扩增与蛋白质结合的DNA序列 第三节 DNA序列测定 DNA Sequencing * DNA序列分析方法的演变和发展 20世纪70年代 双脱氧链终止法：F. Sanger 化学裂解法：A. Maxam和W. Gilbert 20世纪80年代 PCR及自动测序技术 一、DNA序列分析有双脱氧链终止法和化学裂解法 （一）Sanger双脱氧链终止法利用2′，3 ′ -双脱氧核苷酸掺入中 （二）Maxam-Gilbert化学裂解法利用化学试剂裂解修饰碱基止聚合反应 双脱氧链终止法 G A T C 测序反应 电泳 AACGTGGACT AACGTGGAC AACGTGGA AACGTGG AACGTG AACGT AACG AAC AA A 5 3 正极 负极 dd