第六章蛋白质的分离纯化和表征.pptVIP

⑤　加热变性测定法 原因：a． 加热变性使蛋白质天然结构解体，疏水基外露，损坏了水化层b． 蛋白质处于等电点破坏了带电状态。 用途：制豆腐（加热+少量盐卤） 四．蛋白质的颜色反应 1.双缩脲反应 双缩脲是两分子尿素经加热脱氨缩合生成的产物，两分子双缩脲与碱性硫酸铜作用，生成粉红色的复合物—双缩脲铜纳氢氧化物。这一呈色反应称为双缩脲反应。 一切蛋白质和两个肽键以上的多肽化合物都具有双缩脲反应。肽链越长显色越深，由粉红、紫红直到蓝紫色。 2.酚试剂反应（Folin－酚试剂） 酪氨酸、色氨酸还原磷钼酸、磷钨酸为蓝色化合物 微克水平 3.黄色反应 含有酪氨酸、色氨酸的蛋白质的特有反应 蛋白质溶液加入硝酸，产生白色沉淀，加热变成黄色沉淀。硝基苯衍生物 4.乙醛酸反应 蛋白质溶液加入乙醛酸，沿管壁慢慢加入浓硫酸，两相液面出现紫色环 色氨酸、含有色氨酸的蛋白 第六章 蛋白质的分离纯化和表征 重点： 一、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 二、蛋白质的分离纯化方法 三、蛋白质的含量测定与纯度鉴定 难点： 蛋白质分子量的测定 第一节：蛋白质的酸碱性质 1．两性解离 蛋白质分子中有很多酸性解离基团和碱性解离基团，是具有两性解离性质的化合物。 各种解离基团的解离度与溶液的pH有关，pH越低，碱性解离度越大，蛋白质分子带正电荷越多，负电荷越少；pH升高，则解离情况相反。 2．等电点 调节溶液的pH可以改变蛋白质分子的带电状况。在特定pH条件下，某种蛋白质分子所带正负电荷相等，静电荷为零，这一pH 称为该蛋白质的等电点（pI）。等电pH并不是一个恒定的值，它会因溶液中盐的种类和离子强度的影响而有所不同。 等离子点 蛋白质在纯水溶液中的带电状态则没有其他离子干扰，完全由H+的解离和结合来决定，这种条件下的等电点称为等离子点。等离子点是蛋白质的特征性常数。 3．等电沉淀和蛋白电泳 等电沉淀技术：在等电点pH条件下，蛋白质为电中性，比较稳定。其物理性质如导电性、溶解度、黏度、渗透压等都表现为最低值，易发生絮结沉淀。因此，等电点性质常被用于蛋白质的分离制备，被称为等电点沉淀技术。 电泳：带电颗粒在电场中泳动的现象称为电泳。 蛋白电泳：溶液pH值不等于等电点； 直流电场。用于蛋白质的分离和纯化。 双向电泳（two-dimensional electrophoresis）　　如果将等电聚焦电泳与SDS结合起来，就是分辨率更高的一种双向电泳了（下图）。双向电泳后的凝胶经染色蛋白呈现二维分布图，水平方向反映出蛋白在pI上的差异，而垂直方向反映出它们在分子量上的差别。所以双向电泳可以将分子量相同而等电点不同的蛋白质以及等电点相同而分子量不同的蛋白质分开。 一．化学测定法 首先利用化学分析方法测定蛋白质中某一特殊成分（某种元素或某种氨基酸）的百分含量。然后，假定蛋白质分子中该元素只有一个原子（或一分子某种氨基酸），据其百分含量可计算出最低相对分子质量： 最小相对分子质量=已知成分的相对分子质量（或相对原子质量）/已知成分的百分含量×100。例如：测得铁的百分含量为a,则该蛋白的最低相对分子质量为：a/铁的相对原子质量 第二节：蛋白质相对分子质量的测定 二．凝胶过滤法 凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶过滤，分子筛层析或排阻层析。 单个凝胶珠本身象个“筛子”。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。如果将这样的凝胶装入一个足够长的柱子中，作成一个凝胶柱。 原理：当含有大小不同的蛋白质样品加到凝胶柱上时，比凝胶珠平均孔径小的蛋白质就要连续不断地穿入珠子的内部，这样的小分子不但其运动路程长，而且受到来自凝胶珠内部的阻力也很大，所以越小的蛋白质，把它们从柱子上洗脱下来所花费的时间越长。 凝胶中只有很少的孔径可接受大的蛋白。因此，大的蛋白质直接通过凝胶珠之间的缝隙首先被洗脱下来。凝胶过滤所用的凝胶孔径大小的选择主要取决于要纯化的蛋白质分子量。 大小不同的蛋白质分子可以通过凝胶过滤分开。在一定的条件下，被分离的蛋白质的分子量的对数与其洗脱体积成比例，所以常利用这一原理进行天然蛋白质分子量的测定。 三．SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法 SDS：烷基十二酯硫酸纳，变性剂。 1.定义：电泳分离蛋白质是根据蛋白质在电场中的迁移的差别达到分离目的的。蛋白质样品加到一块预先制好的凝胶介质上，只要在凝胶的两端加上电场，就可以达到分离蛋白质的目的，这样的电泳称之凝胶电泳（gel electrophoresis）。 凝胶可以是淀粉凝胶（starch gel）、琼脂糖凝胶（