第三代基因测序原理和应用课件.pptVIP

在单个碱基掺入增长的DNA链时检测它们。当每个dNTP加入时对荧光标记的终止子成像，随后切割，允许下一个碱基的掺入。由于每个测序循环中四种可逆终止子结合的dNTP都存在，所以自然竞争让掺入偏差最小化。根据每个循环的信号强度测定直接检出碱基，与其他技术相比大大降低了原始错误率。最终结果是高度准确的base-by-base测序，避免了序列内容特异的误差，实现了可靠的碱基检出，即使是那些重复序列区和均聚物。 * （4）测序 　　测序方法采用边合成边测序的方法。向反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特异荧光标记的4中dNTP（如同Sanger测序法）。这些dNTP的3’-OH被化学方法所保护，因而每次只能添加一个dNTP。在dNTP被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱掉。接着，再加入激发荧光所需的缓冲液，用激光激发荧光信号，并有光学设备完成荧光信号的记录，最后利用计算机分析将光学信号转化为测序碱基。这样荧光信号记录完成后，再加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dNTP 3’-OH保护基团，以便能进行下一轮的测序反应。 * （4）测序 　　测序方法采用边合成边测序的方法。向反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特异荧光标记的4中dNTP（如同Sanger测序法）。这些dNTP的3’-OH被化学方法所保护，因而每次只能添加一个dNTP。在dNTP被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱掉。接着，再加入激发荧光所需的缓冲液，用激光激发荧光信号，并有光学设备完成荧光信号的记录，最后利用计算机分析将光学信号转化为测序碱基。这样荧光信号记录完成后，再加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dNTP 3’-OH保护基团，以便能进行下一轮的测序反应。 * * 第三代基因测序原理和应用 什么是DNA？ DNA是英文Deoxyribonucleic acid的缩写，中文含义为脱氧核糖核酸。 脱氧核糖核苷酸的类型： 腺嘌呤（A）= 胸腺嘧啶（T） 胞嘧啶（C）= 鸟嘌呤（G） DNA分子的排列顺序是可以检测 的，从而可以解读遗传信息，即测序。 DNA结构（视频） 什么是基因？ 基因是具有遗传效应的DNA分子片段，由许多脱氧核苷酸按照一定的 碱基顺序构成的长链聚合物。 基 因 身高 肤色 智商 胖瘦 基因组：一个细胞内的全套染色体为一个基因组，或是一个细胞中的全部DNA为一个基因组 什么是基因组？  基因组染色体基因 测序技术发展史 第一代测序原理-Sanger测序法 双脱氧链终止法（Sanger法）： 1977年，英国人Fred Sanger 发现，如果在DNA复制过程中掺入ddNTP，就会产生一系列末端终止的DNA链，并能通过电泳按长度分辨。不同末端终止DNA链的长度是由掺入到新合成链上随机位置的ddNTP决定的。 复制叉（Replication fork） DNA ligase：DNA连接酶； DNA gyrase：DNA旋转酶； DnaB helicase：解旋酶 SSB：单链结合蛋白； DNA连接酶（DNA ligase） 功能：连接DNA链3‘-OH末端和另一DNA链的5’-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连成完整的链。 DNA复制 Sanger测序法 第一代测序成果：人类基因组 2001年2月份同时发表，从此有了人类基因组模板。 ATCGAACTTCCATTGCACCAATATAGGTACGTAA ATCGAACTTCC TTGCACCTATATAGGTGTACGTAA 参考序列： 测序所得序列： 碱基缺失 碱基突变 碱基重复 特点：测序长度700-1000bp；通量小，一次96个样本，每个样本1条序列 临床应用：单基因病检测 ，如血友病、白化病、地中海贫血等 第二代测序原理-高通量测序 NextSeq 500 – 灵活通量 废液槽 缓冲液 化学试剂 Flow Cell C A G T C A T C A C C T A G C G T A 5’ G T G T C A G T C A G T C A 3’ 5’ 测序基础原理：边合成边测序(SBS) 如何理解边合成边测序？ 用不同颜色的荧光标记四种dNTP，在聚合酶作用下，按照碱基互补配对原则（A与T配对，C与G配对）进行链的延伸，每延伸一个碱基，碱基释放荧光。通过光学系统捕获荧光，从而获得碱基信息。 MiSeq 建 库 2 HOURS Cluster 1 HOURS 测 序 4 HOURS 信息分析 0.5 HOURS 一体化进行：上样