变性高效液相色谱法检测晚期肺腺癌人类表皮生长因子受体2突变的探索性研究.docVIP

PAGE PAGE 1 变性高效液相色谱法检测晚期肺腺癌人类表皮生长因子受体2突变的探索性研究 　　【摘要】目的：探索性研究变性高效液相色谱法在检测晚期肺腺癌人类表皮生长因子受体2突变中的应用价值。方法：应用变性高效液相色谱法（denaturinghigh-performanceliquidchromatography，DHPLC）检测了52例晚期肺腺癌患者的血液样本提取的DNA中HER2基因20号外显子的体细胞非移码插入突变，并结合直接测序进行了验证。结果：在对52例晚期肺腺癌患者血清标本提取的DNA检测中，通过野生型样本和未知样本的1∶5混合检测，共检出3例HER2基因20号外显子突变，经过DNA测序验证证实均为YVMA非移码插入突变。结论：DHPLC方法可以有效检测出晚期肺腺癌患者血液样本中HER2基因突变基因片段，具有显著应用价值。 　　【关键词】肺癌；腺癌；人类表皮生长因子受体2；突变 　　肺癌是全球总体发病率最高的恶性肿瘤，并且长期为首位的癌症类致死疾病[1-2]。肺癌根据病理形态可以分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌占所有肺癌的85%左右，非小细胞肺癌又可以分为腺癌、鳞癌及大细胞癌。非小细胞肺癌大部分在发现时已经为晚期病例从而失去手术根治的机会，并且其5年生存率只有15%～16%。随着经济社会的发展，肺鳞癌的发生率有所下降，肺腺癌的比率不断上升，目前，已成为最常见的肺癌病理亚型。近年来，对于非小细胞肺癌尤其是肺腺癌的遗传学研究阐明了部分肺癌的发病机理，即EGFR、KRAS、HER2、ALK等基因突变导致了肺腺癌的发生并维持其生长[3-7]。针对特定驱动突变的靶向药物可以使肿瘤产生明显的消退，并显著延长患者无疾病生存期，针对EGFR酪氨酸激酶域突变的小分子抑制剂吉非替尼和厄洛替尼取得了很好的临床效果[3]。 　　人类表皮生长因子受体2（humanepidermalgrowthfactorreceptor-2，HER2）基因，即c-erbB-2基因，定位于染色体17q12-21.32上。HER2基因异常表达、拷贝数增加和体细胞突变常见于许多种人类肿瘤，例如乳腺癌中常见到HER2的蛋白高表达和拷贝数扩增，这部分乳腺癌病例可能从单克隆抗体曲妥珠单抗治疗中获益[8]。前期的研究表明HER2基因构成肺腺癌突变谱的一个亚型，约3.8%的肺腺癌有HER2基因酪氨酸激酶域的突变，其中绝大部分为20号外显子YVMA非移码插入突变[7-9]。由于晚期肺癌病例往往难以取得足够的肿瘤组织标本进行基因测序诊断，如何有效地通过其他途径检测肿瘤体细胞突变是困扰肿瘤科医生的难题。DHPLC技术是一种高通量筛选基因序列突变的方法，具有快速和高敏感性的优点，已经证明可以检测到晚期肺癌患者血清中EGFR基因的突变[10]。本研究旨在探索DHPLC方法检测晚期肺腺癌患者血清中HER2突变的效果，扩展其应用范围。 　　1资料与方法 　　1.1一般资料连续收集本院2006年9月-2010年5月收治的晚期肺癌患者血液样本，经外院已有病理诊断的晚期肺腺癌共52例。其中男31例，女21例，平均年龄（62.09±9.9）岁。其中吸烟者35例，不吸烟者17例；高分化、中分化和低分化肺腺癌分别占13.4%，50.0%和36.6%；Ⅲ期患者7例（13.4%），Ⅳ期患者45例（86.6%）。 　　1.2DNA提取采用QIAmpDNABloodMinikit进行血清DNA抽提，操作根据试剂盒提供的标准步骤。 　　1.3PCR扩增使用HER2基因20号外显子前后内含子引物对外显子进行PCR扩增，引物为5’-GCCATGGCTGTGGTTTGTGATGG-3’和5’-ATCCTAGCCCCTTGTGGACATAGG-3’。反应条件为：95℃2min，95℃30s，61℃30s，72℃40s循环36次，72℃延伸10min，1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增片段。 　　1.4变性高效液相色谱分析DHPLC检测使用WAVE4500核酸片段分析系统（Transgenomic公司），试剂主要包括TEAA和乙腈。步骤主要包括：（1）缓慢变性，95℃变性5min，然后以0.03℃/s速率缓慢复性至25℃，使杂合子形成异源双链；（2）确定熔解温度，根据温度预测软件对DNA片段进行序列分析，确定熔解温度；（3）取10μl缓慢变性PCR产物上样，分析流出峰峰形。 　　1.5直接测序对于DHPLC检测出可疑突变的样本，将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后切胶回收，样本送商业测序公司进行检测。 　　2结果 　　笔者共对52例收集到的晚期肺腺癌患者血清样本进行了检测。通过将野生型对照与检测样本1：5制成混合样本上机检测，结果见图1，共筛选到了3个可疑混合样本（图1c、e、g）。重复进行的P