以前做冰冻切片.docVIP

冰冻切片与漂片免疫组化 以前做冰冻切片,总是遇到问题,后来查文献,自己又做实验比较,总算找到了又快又好地办法, 拿出来和大家分享一下.1. 取脑一定要在冰上操作,液体也一定用冷的2. 30%蔗糖一定要充分,最好中间换液一次, 20%的可以不做3. 沉淀后冻存,一定要快冻, 最好在干冰上操作.4. 最重要的一点, 灌注的时候, 不要用0.1M PB, 用0.01M PBS. 以前不知道,很多书上写的都是0.1M PB,后来自己用了发现还是有洞. 为了这个,我还专门作了对照实验,结果0.01M PBS更好一些, 原因不知道为什么, 但是事实如此. (理论上高浓度液体更利于保护细胞不会因为冰冻损伤)5. 如果做磷酸化的抗体,一定记得在灌注液里加一定的抑制剂,如NaF等. 蔗糖俺用25%/PBS 的，不用换液，只要过夜12个小时就能沉下去了。包埋的时候不用冲洗，但是要注意一定要用吸水纸擦干蔗糖溶液，否则切片有麻烦 我做切片的时候，先用20％蔗糖（PB配）沉底，再用30％蔗糖沉底，这样脱水比较充分。一般是等切片机温度达到-22度之后，再将包埋好的脑组织放入。脱水不充分也会导致切片有洞，而且片子容易向内卷，很不好贴。一直这样做了很久，效果都还不错。 取脑后，直接投到液氮？？我试过，由于脑组织水分多，下液氮后直接就碎了～～ 防止脑袋冻碎办法：先准备好一个保温杯，倒入适量的液氮，然后在杯身中放一个纸杯（塑料或玻璃杯禁用），再在杯中放一金属片，以防止纸杯翻倒，动物脑袋取好后，先放在一张小锡箔纸上，然后连锡箔纸一起转移至杯中的金属片上面，盖上保温杯盖，3-5分钟后，见大脑表片颜色变白，表示冷冻完全，随即将大脑用锡箔纸包好，转入-80度冰箱长期保存。脑片切好后保存方法：1、先用手指在玻片（已挂好胶）后均匀轻轻过一下，将脑片组织贴在玻片上。2、37度干燥箱中烘干。3、放入切片盒中，盖紧盒盖，并用胶带将切片盒封严，外用样品袋包扎严实，即可防止水汽进入。于-20度可保存半年以上，于-80度可保存一年以上。切忌经常打开盒子。  想请问0.01M PBS的配方，谢谢！ 0.01M PBS配方（pH7.2～7.4）（500 ml）Na2HPO4?12H2O2（分子量358.14） 2.9gNaH2PO4?2H2O2 （分子量156.01） 0.295gNaCl 4.5gddH2O 500 ml混匀，完全溶解后，用H3PO4调PH值至pH7.2～7.4。用前配制或者于4度短期保存。 用Google搜了一下发现网上很多0.01M PBS配方是：NaCl 8.0g ； KCl 0.2g ； Na2HPO4 1.44g ； KH2PO4 0.24g ；加蒸馏水 至 1000ml，调节pH 到 7.4（pH 有用Na2HPO4或KH2PO4调节也有用HCl调的） 需要注意的是，通常所说的浓度0.01M 指的是缓冲溶液中所有的磷酸根浓度，而非Na 离子或K 离子的浓度，Na 离子和K 离子只是用来调节渗透压的。我计算了下两种配方磷酸根浓度都在0.01M ，而jmfan的配方浓度更精确些，但是发现其配方中没有钾离子，不知道会不会在渗透压上有影响？另外对调PH的问题，我们一直都是用HCl调的，没有用过H3PO4或其盐，有没有大虾对这方面清楚的呢？ 其实PBS的配方的确有很多，不尽相同，这里所说的PBS就是指磷酸钠盐缓冲液，当然还有磷酸钾盐缓冲液，即KPBS，我做IHC时是用磷酸钠盐缓冲液的，这2者对实验影响应该不是很大。楼主可以查一些与你检测指标相关的文献，在文献的实验方法中，会注明是用磷酸钠盐缓冲液还是用磷酸钾盐缓冲液的。至于调节PH问题，一般是用与缓冲液相对应的弱酸根离子或弱碱性离子来调节的，所以调PBS的PH时理所当然是H3PO4来调节的，当然用HCL或盐也可以的，但不常用的，并且HCL是强酸，挥发性，稍不小心就很容易调过的还有一点就是：我给你的那个配方，如果水的PH值没有问题的话，按相应质量的溶质配好后的PBS的PH为7.3左右，所以可以不用调PH即可用，楼主可以试试看 严格地说PBS指配方：0.01M PBS配方（pH7.2～7.4）（500 ml）Na2HPO4?12H2O2（分子量358.14） 2.9gNaH2PO4?2H2O2 （分子量156.01） 0.295gNaCl 4.5gddH2O 500 ml引用中的这个配方（NaCl 8.0g ；KCl 0.2g ；Na2HPO4 1.44g ； KH2PO4 0.24g ；加蒸馏水 至 1000ml，调节pH 到 7.4）是1X DULBECCOS PHOSPHATE BUFFERED SALINE (PBS) WITHOUT CALCIUM