流式配色及析课件.pptVIP

染料的亮度与抗原表达强度相匹配 Panel2 避免补偿 CD45-FITC Dim CD4-PE CD45 FITC 漏到 PE， CD4 PE 弱信号分不开 CD45- PerCP Dim CD4-PE CD45 PerCP 不漏到 PE ，弱 CD4 可以分开 Uncompensated Compensated data spread due to spillover 避免补偿 1）采用多激光激发减少重叠 2）避免双激发荧光染料 488激发：fitc pe percpcy5.5 pe-cy7 635激发：apc apc-cy7 405激发：BV421 BV510 CD3/CD4/CD8 可选 fitc apc-cy7 BV510 减少Pe-cy5，Amcyan等荧光抗体的使用率； 0 hours 2 hours 22.5 hours PE CD8 CD3 PE-Cy5 PE-Cy7 样本曝光时间 PerCP 减少偶联染料的使用率： 选择更稳定的偶联染料： 自发荧光多的选择用635激发的染料 BD HorizonTMV500 CD45 BDTM APC-H7 CD14 FITC CD8 PerCP-CyTM5.5 CD4 BD HorizonTM V450 CD3 APC CD19 PE-Cy?7 CD56 PE CD80 Fluorochrome Antigen Perfect! 多色组合原则 1、要用什么抗体？要用多少种抗体？ 最多8种 4+2+2 2、强弱搭配 染料的亮度与抗原表达相匹配 3、避免补偿 不同激光器激发/ 避免双激发染料 4、减少偶联染料 使用更稳定的偶联染料 5、自发荧光高的样本： 红激光激发 优宁维流式免费课堂 流式实验上机前的准备 CD19 CD4 CD56 CD14 CD16 CD8 CD(Cluster of Differentiation) marker: 用于鉴定白细胞的分类，不同的白细胞表面带有不同的CDmarker 通过带有荧光标记的抗体和抗原特异性结合： CD19 CD4 CD56 CD14 CD16 CD8 流式鉴定白细胞的各种亚型： 表面蛋白流式检测步骤： Stain Analyze Wash*2 检测胞内细胞因子: 胞内因子流式检测步骤： Fix Permeabilize Stain Analyze 表面染色和胞内染色的区别？ CD4 IFN-r Th1细胞 CD4 IFN-r 正常染色情况下，由于抗体无法穿过完整的细胞膜，胞内因子无法被染上颜色，仅表面marker染色成功； 通过固定破膜建立胞内染色通道 IFN-r Th1细胞 表面染色 固定破膜 胞内染色 固定剂和破膜剂 固定剂： 起稳定细胞膜、保持细胞膜表面抗体与抗原结合的作用； 破膜剂： 使流动的、完整的细胞膜产生小孔以利于抗体进入细胞； （少量沉淀正常，皂角苷沉降） 破膜的位置不同，破膜剂的选择不同： 对于核内/转录因子的检测，我们需要采用针对破核的破膜剂； 固定剂和破膜剂 This kit enables the fixation and permeabilization of cells which is necessary for staining intracellular cytokines with fluorochrome-conjugated anti-cytokine antibodies. The BD Pharmingen? Transcription Factor Buffer Set is optimized for fixing and permeabilizing cells prior to immunofluorescent staining and flow cytometric analysis of cells that express specific intracytoplasmic and intranuclear proteins. 胞内因子和核内因子的同时检测： 问：同时检测Th1/Th2/Th17和Treg这几个细胞时是否有推荐的 buffer？ 答：核内因子和胞内因子共测时一般推荐使用BD:562574转录/核内因子固定破膜试剂盒； 但是： 经验证，FoxP3 与 IL-4无法同时检测 ，但 FoxP3和IL-17a、 IFN-γ一起染色良好。 故当需要同时检测th2/Treg时需要准备2种固定破膜试剂盒并分开检测。 胞内因子的含量与检测效果 为何同时检测Treg和Th，Th的阳性率很低而Treg正常？ 胞内因子的含量与检测效果 为何同时检测Treg和Th，Th的阳性率很低而Treg正常？ 仅活化状