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qPCR实验作业流程 PAGE PAGE 5 Q-PCR实验流程 ①实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打开15-20分钟。②超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套，RNA抽提需带口罩。③取EP管/枪头时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。取完EP管/枪头后，袋子及时封好。④橡胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，移液器在一天工作结束后调至最大量程，并用75%乙醇清洁移液器，枪头盒及超净台面。⑤实验进行的过程中或观看实验时，没有带口罩不要在超净台前讲话。 总RNA抽提 1）细胞培养皿中细胞样品用1*PBS洗两次后，用1ml枪将PBS吸干净，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，吹打混匀，并吸至1.5ml RNase free EP管中使细胞充分裂解，室温静置5min； 组织样品用液氮充分研磨，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，混匀，室温放置5min使其充分裂解；（管盖与管壁都需标记样品名称） 加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置3-5min；（离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与第一步的顺序一致） 3） 4℃下，14,000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase 沉淀RNA：加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6-8次）（不应用振荡器混匀），室温静置10min； 4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀（如离心后仍不见EP管底部有沉淀，应将EP管放置在-80度冰箱过夜，继续在4℃下， 用75％乙醇洗涤两次（12,000g离心5min）（加入乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可，不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀），超净台风干；沉淀不能过干或过湿，过干则不易溶解，过湿则乙醇残留。 视沉淀量加入适量DEPC水（至少15ul）溶解沉淀。 三、去基因组 使用RNase-free的DNase ?（Promega），按以下体系配置反应液，37℃消化30min，65℃ RNA DNase ? 10 x buffer H2O(RNase free) RNasin 30 20 10 39.5 0.5 μl μl μl μl μl 总体积 100 μl 然后按以下步骤操作： 1) 加入等体积的苯酚/氯仿，上下颠倒混匀，室温放置5min，后14,000rpm，离心15min，取上清。 2) 加入等体积的氯仿，上下颠倒混匀，静置分层后14,000rpm，离心15min，取上清。 加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6-8次），-20℃静置15 4℃下，14,000g 用75％乙醇洗涤两次（12,000g离心5min），超净台风干； 加入适量DEPC水（至少15ul）溶解沉淀。 四、总RNA纯度和完整性检测 纯度检测：取1μl RNA样品50倍稀释，在核酸蛋白检测仪上测定OD值，OD260/OD280的比值大于1.8，说明制备的RNA较纯，无蛋白质污染。 总RNA完整性检测：取RNA样品1μl，1％琼脂糖凝胶电泳80V×20min，EB染色10min，用凝胶成像系统观察并拍照，总RNA的5s rRNA， 18s rRNA和28s rRNA条带，三条条带完整的话即可证明总RNA抽提比较完整。 五、逆转录 1. mRNA： 在RNase free的PCR管中配置下列溶液. Total RNA H2O 1.0 μg μl 总体积 12 μl  将上述溶液吹打均匀，置85℃保温5min，使RNA变性。随后立即冰上致冷， 以防止RNA复性； 在该PCR管中加入下列试剂（Promega） oligo（dT） Random primer 10mM dNTP RNase inhibitor 5 x buffer M-MLV 0.5 0.5 2.0 0.5 4.0 0.5 μl μl μl μl μl μl 总体积 8.0 μl 将上述20μl反应溶液30℃ 42℃保温5 85℃保温10min -20℃ 2. microRNA： 使用茎环逆转录法，原理如下图： 在去RNase的PCR管中配置以下溶液. total RNA X个miR逆转录引物 H2O 1.0 0.5*X μg μl 总体积 12.5 μl  2）将上述溶液混匀，85℃孵育5min，以打开