蛋白质分析的意义.pptVIP

蛋白质分析的意义;蛋白质分析的意义;蛋白质的分析方法 ;回顾一下等电点的有关知识 ; 蛋白质是由a氨基酸组成，氨基酸通过肽链连接起来成为多肽，长的多肽就被称为蛋白质。氨基酸的种类和序列决定蛋白质的性质，蛋白质末端有-NH3+， -COO- ，侧链有-NH3+，-COO-，-S-等酸、碱性基团，可见蛋白质为两性物质，有等电点。;电泳的原理 ; 在电场中，速度通常用泳动度来表示。泳动度是带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。即： U=v/E=(d/t)/(V/L)=(d/V)*(L/t) 式中u---------泳动度，cm2/(V.s) V---------泳动速度，cm/s E--------电场强度,V/cm d-------颗粒泳动距离，cm L------支持物有效长度，cm V------实际电压，V t-----通电时间，s 通过测量d,L,V,t,即可计算出颗粒的泳动度，而当外界因素一定，泳动度是一物质的特性，通过测泳动度，可以鉴别待测物。;蛋白质等电聚焦电泳的基本原理 ;2．等电聚焦中pH梯度的形成： pH梯度的形成依靠有缓冲作用的两性载体电解质，载体电解质是一系列多氨基多羧基的混合物，其pI分布在2.5到10之间，载体两性电解质溶液的pH大约是该溶液pH范围的平均值。在没有电流时，所有载体两性分子都带电荷，所带总的净电荷为0。 ;第二步：; 根据两性电解质的性质，在泳动过程中不断地与溶液交换质子，当达到平衡时，即两性电解质得失质子相等，不再出现质子交换，载体两性电解质至达等电点并停留在自己的pI区域 ，pI即是此处的pH值，于是载体电解质分离为连续pH不同的条带，从而形成连续的多个pH缓冲区。由于凝胶的防对流作用，可使pH梯度保持稳定不变。; 3蛋白质分子分离了 如果把蛋白质溶液与载体两性电解 质混合，随时着pH梯度的形成，蛋白质 也将在自己的pI处沉淀下来。这样蛋白 质就被分离开了。再经过后续处理，就 可以对蛋白质进行定性和定量分析。;4．载体两性物质的选择 作为好的两性电解质载体必需符合下列要求: (1).有足够的缓冲能力，以便能形成pH梯度，而不受蛋白质等两性物质的影???。 (2).在等电点处必需有足够的电导，以便使一定的电流通过。而且要求各不同pI的载体有相同的电导系数，使整个体系中的电导均匀。 (3).相对分子质量要小，以便与被分离的高分子物质用分子筛或透析法分开。 (4).化学组分不同于被分离物质，以免干扰测定。 (5).不与被分离物质起化学反应，也不会引起被分离物质变化。;5．支持pH梯度的介质选择 等电点聚焦电泳的主要条件之一是具有稳的pH梯度，以防上对流，避免已分离的物质再度混合。支持pH梯度的介质有如下两类 (1)密度梯度溶液 密度梯度溶液由一个重溶液和一个轻溶液在梯度混合器中混合而成。最常用的密度梯度溶质是蔗糖，因为它对蛋白质无害且有保护作用。轻液一般用水。 (2)凝胶 等电点聚焦广泛使用凝胶作为支持pH梯度的介质。应用最多的是聚丙烯酰胺凝胶。;参考文献： 郭勇 《现代生化技术》 科学出版社 周先碗 于晓倩 《生物化学仪器分析与实验技术》 化学工业出版社 李元宗 常文保 《生化分析》 高等教育出版社 赵永芳 《生物化学技术原理及应用》 科学出版社 蔡维平 《基础化学实验（一）》科学出版社 李克安 《分析化学教程》 北京大学出版社; 谢谢!