酪氨酸酶的提取及其酶促反应动力学研究.docVIP

酪氨酸酶的提取及其酶促反应动力学研究 一、 实验目的 1.认识生物体中酶的存在和催化作用，了解生物体系中在酶促反应的特点，认识一些生物化学过程的特殊性。 2.掌握生物活性物质的提取和保存方法，了解研究催化反应特别是生物化学体系中催化过程的基本思想和方法。 二、 实验原理 酶（enzyme）是由生物细胞合成的、对特定底物（substrate）起高效催化作用的蛋白质，是生物催化剂。生物体内所有的化学反应几乎都是在酶的催化作用下进行的。只要有生命活动的地方就有酶的作用，生命不能离开酶的存在。在酶的催化下，机体内物质的新陈代谢有条不紊地进行着；同时又在许多因素的影响下，酶对代谢发挥着巧妙的调节作用。生物体的许多疾病与酶的异常密切相关；许多药物也可通过对酶的作用来达到治疗的目的。随着酶学研究的深入，必将对人类社会产生深远影响和作出巨大贡献。 酶的化学本质是蛋白质。结构上，同样具有一、二、三级结构，有些酶还具有四级结构。分子的化学组成上，有单纯酶和结合酶之分。单纯酶分子是仅由蛋白质构成的酶，不含其他物质，如脲酶、活化蛋白酶、淀粉酶、核糖核酸酶等等。结合酶分子是由蛋白质分子和非蛋白质部分组成，前者称为酶蛋白（apoenzyme），后者称辅助因子（cofactor）。辅助因子是金属离子或有机小分子。酶蛋白与辅助因子结合形成的复合物称全酶（holoenzyme），酶蛋白和辅助因子各自独立存在时，均无催化活性，只有全酶才有催化活性。在酶促反应中酶蛋白决定着反应的专一性和效率，而辅助因子则决定着反应的种类和性质。 辅助因子按其与酶蛋白结合的紧密程度和作用特点，一般分为辅酶（coenzyme）和辅基（prosthetic group）。辅酶是指辅助因子与酶蛋白结合松弛，没有固定的组成比，往往可用透析或超滤法除去，在反应中作为底物接受质子或基团后离开酶蛋白，参加另一酶促反应并将所携带的质子或基团转移出去，或者相反。而辅基是指与酶蛋白结合比较紧密，与酶蛋白有一定的组成比，不能通过透析或超滤法除去，在反应中辅基不能离开酶蛋白。 辅助因子中大部分是金属离子，约占2/3。小部分是稳定的有机小分子。常见的金属离子有K+、Na+、Mg2+、Ca2+、Cu2+(Cu+)、Zn2+、Fe2+(Fe)3+等。金属离子以辅基出现的称金属酶，以辅酶出现的称金属激活酶。金属辅助因子的作用是多方面的，或者作为酶活性中心的催化基团参与催化反应，传递电子；或者作为连接酶与底物的桥梁，便于酶对底物起作用；或者是稳定酶的构象所必需的；或者中和阴离子，降低反应中的静电作用等。 有机小分子的辅助因子，主要是参与酶的催化过程，在反应中传递电子、质子或一些基团。 酶分子中能与底物作用或结合形成酶 - 底物中间配合物的区域称酶的活性中心。对于结合酶而言，辅酶（辅基）分子或分子中的某一部分结构往往就是活性中心的组成部分。 酶既具备一般非生物催化剂的加快反应速度的功能，又具有一般催化剂所不具备的生物大分子的特征。 酶与一般非生物催化剂相比，具有以下几个特点： 1.酶的主要成分是蛋白质。它具有表现活性和专一性所必需的空间结构，以提供反应中心。由于蛋白质遇高温、强酸、强碱、重金属盐或紫外线等容易变性而失活，所以酶促反应都是在比较温和的条件下进行的，如人体中的各种酶促反应，一般都在体温（37℃）和pH约为7的条件下进行。 2.酶促反应所需的活化能较低。如使1 mol蔗糖水解所需活化能高达32万卡，用H+ 离子作催化剂时活化能降至2.1万卡，若用蔗糖酶催化时只需0.94万卡。 3.酶的催化效率非常高。酶的催化效率通常比非催化反应高108 -1020 倍，比一般非生物催化剂高107 -1013 倍。如存在于血液中能催化H2CO3 分子分解的碳酸酐酶，它的催化效率非常高，每一分子每分钟可以催化1.9×107个H2CO3 分子分解。正是因为血液中有这样高效率的酶，才能及时完成排放CO2 的任务，维持血液的正常生理pH值。 4.酶具有高度的专一性。酶对所作用的底物有严格的选择性，每一种酶只能对某一类物质甚至只对某一种物质起催化作用，这是一般非生物催化剂所无法比拟的。 酶的以上特性已引起化学工作者的极大兴趣，如酶正被作为分析试剂、探针得到应用；生物酶的化学模拟已广泛开展，将为研制高性能的工业催化剂奠定基础。酶的电化学研究的开展还开辟了生物电化学的新领域。酶化学是一门交叉学科，对其研究具有广阔的前景。 酶促反应动力学是酶化学的主要内容之一，这方面的研究具有重要的理论和实践意义。 本实验拟通过从土豆等物中提取酪氨酸酶并就其酶促反应的动力学研究其活性，使同学们对酶有个初步的认识。当土豆、苹果、香蕉或蘑菇受损伤时，在空气作用下，很快变为棕色，这是因为它们的组织中都含有酪氨酸和酪氨酸酶，酶