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PCR实验报告 PAGE PAGE 1 ———————————————————————————————— 作者： ———————————————————————————————— 日期： 普通生物学实验报告 实验名称：用PCR扩增的方法鉴别不同物种来源的肌肉 一、特异性目的片段DNA的扩增 （一）实验原理 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，其基本原理为DNA的半保留复制。PCR技术由①高温变性模板 ；②引物与模板退火；③引物沿模板延伸这3步反应组成一个循环，通过多次循环反应，目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将模板DNA置于高温下（通常为93℃-94℃），使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因的两条单链互补结合；热稳定DNA聚合酶（Taq酶)在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板按5’→ 3’的方向延伸，合成互补链。 本实验采用物种特异性引物扩增的方法来鉴定3种不同物种来源的肌肉。以不同物种来源的动物DNA为模板，用物种特异性的引物进行PCR扩增，只有在模板和引物的物种相对应的情况下才会有特异性条带的出现。应用此方法，可以特异性地检测样品中痕量的特定DNA成分。 实验步骤 不同反应体系的配制 按下表将各成分分别加入一做好标记的无菌PCR管中，配制50μl的PCR反应体系，注意酶要最后加，加完后将PCR管放置在冰上。 10×PCR缓冲液 5μl 5μl 5μl 5μl 5μl 5μl dNTP mix(2,5mM each) 4μl 4μl 4μl 4μl 4μl 4μl 模板 DNA1 2μl 2μl _____ _____ _____ _____ DNA2 _____ _____ 2μl 2μl _____ _____ DNA3 _____ _____ _____ _____ 2μl 2μl 引物 Pork1 (10μM） 2μl _____ 2μl _____ 2μl _____ Pork2 (10μM） 2μl _____ 2μl _____ 2μl _____ Beef1 (10μM） _____ 2μl _____ 2μl _____ 2μl Beef2 (10μM） _____ 2μl _____ 2μl _____ 2μl Taq酶（5U/ μl） 0.25μl 0.25μl 0.25μl 0.25μl 0.25μl 0.25μl ddH2O 34.75μl 34.75μl 34.75μl 34.75μl 34.75μl 34.75μl 将上述混合液稍加离心，约10s左右。取下后立即置于PCR仪中，盖紧热盖，定好PCR仪的反应程序，执行扩增程序。 反应程序为： 预变性 94℃ 5min 变 性 94℃ 5s 退 火 50℃ 5s 循环30次 延 伸 72℃ 20s 后延伸 72℃ 5min 3.反应结束后，终止程序，将PCR管取出，放置于4℃，待电泳检测。 二、水平式琼脂糖凝胶电泳法鉴定PCR产物 （一）实验原理 核酸分子是两性解离分子，在高于其等电点的电泳缓冲液（pH 8.0-8.3)中，其碱基不解离，而磷酸集团全部解离，核酸分子因而带负电荷，电泳时向正极迁移。琼脂糖主要是从海洋植物琼脂中提取而来并经糖基化修饰，为一种聚合链线性分子。使用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质，发挥分子筛功能，使得大小和构象不同的核酸分子的迁移率出现较大差异，从而达到分离的目的。 实验步骤 制胶 称取2.4g琼脂糖，放入250ml的锥形瓶中，加入120ml1×TAE缓冲液，微波炉高火加热约40s直至沸腾，摇动，使琼脂糖分散，在重复煮沸2次，直至溶液澄清透明。待琼脂糖温度降到60℃左右时，按1:20000的浓度加入Golden View,混匀后倒入已插上合适齿孔梳子的模具中，静置，约30-45min后凝胶完全凝固。轻轻的垂直拔出梳子，将凝胶取出，放入电泳槽中，添加1×TAE缓冲液至刚好没过凝胶（有样品孔的一端靠近负极）。 加样 取15μlPCR产物与3μl的6×上样缓冲液混匀，加入到凝胶样品孔中。每加完一个样品应更换一个吸头。加样前，要记下加样