重组DNA技术与蛋白质工程.pptVIP

　 　基因重组与基因工程 Genetic Recombination and Genetic Engineering　 第 一 节 重组DNA技术 一、相关概念 DNA克隆 工具酶 目的基因 基因载体 二、基本原理及操作步骤 （二）工具酶 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Ⅰ 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶 （三）目的基因 cDNA (complementary DNA)：为具有与某RNA链呈互补的碱基序列的单链DNA 基因组DNA (genomic DNA) 含有复制起始点，能在宿主中独立复制； 分子量小，以容纳较大的外源DNA； 不能插入宿主基因组，易于分离和纯化； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），由限制性内切酶的识别序列组成。 （一）目的基因的获取 1. 化学合成法 　　已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 2. 基因组DNA文库(genomic DNA library) 3. cDNA文库(cDNA library) 4. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) PCR的反应体系　 模板DNA 引物 4种dNTP Taq DNA聚合酶 含Mg2+的缓冲液。 PCR的基本反应步骤及原理　 （1）变性，加热至95 ℃，使模板DNA解开成单链； （2）退火，温度降至适宜，使引物与模板互补结合； （3）延伸，温度升至72 ℃ ，DNA聚合酶以4种dNTP为底物，在引物的3’-OH上，合成与模板互补的DNA新链。 PCR反应条件　 　　 　　　　　　 　 　 三、重组技术与医学的关系 　 　 复习思考题： 　1. 概念： （1）克隆 （2）转化 （3）转位 （4）基因工程 （5）转座 （6）限制性核酸内切酶 （7）载体 （8）质粒 2. 简述基因工程的基本过程。 3. 简述目的基因的主要来源或途径。 1. 产前诊断 2. 携带者测试 3. 症候前诊断 4. 遗传病易感性 （五）遗传疾病的预防 mRNA cDNA 双链cDNA 重组DNA分子 cDNA文库 反转录酶 载体 受体菌 复制 3.　cDNA文库　 逆转录酶 A A A A T T T T AAAA SI核酸酶 DNA聚合酶Ⅰ 碱水解 T T T T 　　DNA序列是已知的，或两端已知，可以利用选择性体外扩增DNA的方法——PCR。 是一种在体外利用酶促反应大量获得特异序列的基因组DNA或cDNA的专门技术，又称为无细胞的分子克隆。 4. 聚合酶链反应（PCR） 变性 95?C 延伸 72?C 退火 Tm-5?C Tm指的是把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度 PCR反应的基本原理 （三）外源基因与载体的连接 1. 粘性末端连接 方式：(1)同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接 （二）克隆载体的选择和构建 Bam HⅠ切割反应 GGATCC CCTAGG T4 DNA连接酶 15oC GATCC G G CCTAG + 目的基因用 Bam HⅠ切割 载体DNA用Bam HⅠ切割 重组体 载体自连 目的基因自连 同一限制酶切位点连接 不同限制酶切位点的连接 Eco RⅠ切割位点 Bg lⅡ切割位点 + EcoRⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。 2. 平端连接 适用于：限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端 目的基因 载体 限制性内切酶 限制性内切酶 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 载体自连 目的基因 自连 3. 同聚物加尾连接 在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。 5′ 3′ 3′ 5′ 载体DNA 5′ 3′ 3′ 5′ 目的基因 限制酶或机械剪切 限制酶 5′ 3′ 　3′ 5′ 　　　　 5′ 3′ T(T)nT T(T)nT 3′ 5′ 5′ 3′ 　3′ 5′ 　　　　　5′ 3′ A(A)nA 　A(A)nA 3′ 5′ λ-核酸外切酶 λ-核酸外切酶 末端转移酶 + dATP 末端转移酶 + dTTP T(T)nT A(A)nA A(A)nA T(T)nT T4 DNA连接酶 15oC 重组体 4. 人工接头(linker)连接 由平端加上带有新的酶切位点的接