第3章 基因工程制药技术.pptVIP

重组DNA技术是在分子水平对基因进行体外操作，因而也称为分子克隆(molecular cloning)或基因克隆。 所谓克隆(clone)：是指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。;分子克隆：是在体外对DNA分子按照既定的目的和方案进行人工重组，将重组分子导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得DNA分子大量复制，并使受体细胞获得新得遗传特征的过程;基因工程最基本的必备的材料： 工具酶 载体 目的基因 原核或真核宿主细胞 ;分子克隆的基本过程: 分：得到目???基因 切：将目的基因和载体用适当的限制性内切酶切割 接：将目的基因和载体连接，形成重组子 转：将重组子转到适当的宿主细胞中 筛：筛选出含正确重组子的宿主细胞，扩增;第一节?? 基因工程中常用工具酶;工具酶分类 使核酸降解的核酸酶类：核酸内切酶、核酸外切酶 催化核酸合成的酶类：DNA聚合酶，RNA聚合酶，连接酶，逆转录酶 核酸修饰酶类：甲基化酶，激酶，基团转移酶， 磷酸酶等;一、 限制性核酸内切酶;限制性核酸内切酶(restriction endonuclease，RE) 是由细菌自己产生的一种能识别双链DNA中的特定序列，并以内切方式水解核酸中磷酸二酯键的核酸内切酶。;1．限制性核酸内切酶的分类：;Ⅲ型RE；由两种亚基组成。需Mg++，ATP为辅助因子；切割位点靠近识别序列但较难预测。一般在25~27bp范围内切割。现已报道4种。 I、Ⅲ型RE酶同时具有限制(剪切)与修饰(甲基化)两种功能并依赖于ATP，切割DNA链的位置远离识别序列，因此I型和Ⅲ型酶在DNA重组技术中都不常用。;Ⅱ型RE实际应用价值最大，这是因为： ①Ⅱ型酶只具有限制性活性，无甲基化修饰活性； ② 对DNA的切割要求严格的序列作为靶位点，切割精确； ③ 此类酶作用时只需Mg2+参与，无需ATP。 因此Ⅱ型限制性核酸内切酶是基因工程中剪切DNA分子的常用工具酶，被誉为“分子生物学家的手术刀”。;2．限制性内切酶的命名 目前已广泛采用Smith和Nathams于1973年提出的命名系统： 限制性内切酶第1个大写字母：来自细菌的属名(genus)， 第2、3个小写字母：来自种名(species)， 第四个字母代表菌株(strain);3．Ⅱ型限制性内切酶的作用特点： 被分子生物学家广泛研究应用，现已发现有200多种识别序列的RE MW=60KD的单链多肽 最适pH：6~8 NaCl有抑制作用，Mg2+ 激活，巯基有保护作用 热不稳定。;作用特点： 有严格的识别、切割的DNA序列，并以内切的方式水解双链DNA中的磷酸二酯键。 识别序列一般为4～6个碱基对。 切割靶序列的大小决定了切割DNA链后产生的DNA片段的长短 切割后产生平头或粘性末端。 只需Mg2+，不需ATP。;4. Ⅱ型酶切割dsDNA可产生两种不同的切口 1. 平头末端(blunt end) 即在识别序列的对称轴上进行切割； 2. 粘性末端(cohesive end) 即在识别序列的两个对称点切开DNA双链，产生末端带有单链尾巴的切口。根据突出端不同分为：5’粘性末端和3’粘性末端。;Ⅱ型酶切割dsDNA产生的两种不同的切口;5. 三类特殊性质的Ⅱ型限制性内切酶： 同裂酶(isoschizomer)：又称源同异工酶，即识别位点相同，但切割位点可以相同，也可以不同，例如Sam I(CCC↓GGG)和Xma I(C↓CCGGG) ; Sau3A I BamH I GATC GGATCC CTAG CCTAGG SauI Xho I GTCGAC CTCGAG CAGCTG GAGCTC;可变酶：此种酶所识别DNA序列中的一个或几个碱基是可变的，并且识别序列往往超过6个碱基对，例如Bstp I识别序列为：GGTNACC，其中N为一可变碱基。;6. RE识别序列呈反向对称，分为四种类型;简并序列（degenerate sequence）又称“松弛”特异识别，即识别位点中某些核苷酸可以被其他核苷酸替换。 ↓ 如：ＡｖａⅡ：5’—Ｇ　ＧＡ／ＴＣＣ—3’ 　　　　　　　3’—ＣＣＴ／ＡＧ　Ｇ—5’ 　　　　　　　　　　　　　　 ↑ 非回文结构：　　　 　　　　　　　　　　　　　　 ↓ 如：ＭｂｏⅡ：5’—ＧＡＡＧＡＮ —3’ 　　　　　　　3’—ＣＴＴＣＴＮ —5’ 　　　　　　　　　　　　　　 ↑;7．限制性内切酶的应用;8. RE使用时的注意事项;二、DNA聚合酶 DNA polymerase;1．DNA聚合