第二章核酸化学下.pptVIP

核酸化学 RNA的结构和功能 大多数天然RNA分子是一条单链 局部区域形成如DNA那样的双螺旋结构，按照A-U，G-C进行配对，不能配对的碱基则形成环状突起，参与螺旋形成的核苷酸约占40~70% RNA主要有mRNA、rRNA和tRNA三大类，还包括一些小分子RNA如核内小分子RNA（snRNA）、反义RNA(asRNA)等 tRNA、rRNA和mRNA的比较 tRNA tRNA主要作用是将氨基酸转运到核糖体-mRNA复合物的相应位置用于蛋白质合成 20种基本氨基酸每一种都至少有一种tRNA tRNA分子较小，平均沉降系数为4S 大多数tRNA分子具有类似的三叶草二级结构 tRNA三叶草二级结构 The basic principle of translation tRNA中常见的修饰核苷 酵母丙氨酸-tRNA的核苷酸序列 酵母苯丙氨酸-tRNA三级结构(1) rRNA rRNA主要分布在核糖体(ribosome)内 核糖体由约40%的蛋白质和60%的rRNA组成，rRNA占细胞RNA总量的80% 核糖体由大小不同的两个亚基组成，每个亚基含有不同的rRNA rRNA 原核生物的核糖体和rRNA 大肠杆菌16S rRNA二级结构 生物的分类（1） 不同种系的16S rRNA的二级结构 mRNA 约占细胞总RNA的3%~5%，代谢活跃，寿命较短，分子长度变化很大 mRNA的核苷酸序列决定相应蛋白质的氨基酸序列 原核生物mRNA的转录和翻译在细胞同一空间进行 真核生物mRNA的前体包括内含子和外显子，经加工后变为成熟的mRNA，指导蛋白质合成 RNA的其他功能 RNA在DNA复制、转录、翻译中均有一定的调控作用，与细胞内或细胞间一些物质的运输和定位有关 1981年Cech发现了RNA的催化作用，并提出核酶（ribozyme) 的概念，彻底改变了以往酶只有蛋白质的观念 Tetrahymena rRNA前体自剪切 19-IVS 作为催化剂 核糖核酸酶P的催化作用 核糖核酸酶P(Ribonuclease P)是由两部分组成的，一部分是377个核苷酸的RNA分子，另一部分是分子量约为20,000的蛋白质。两部分都是其催化活性所必需的，但是在非生理条件下RNA部分能单独完成其催化断裂的功能 细胞中的信息流 The RNA World Hypothesis 核酸的性质 一般理化性质 核酸的紫外吸收性质 核酸结构的稳定性 核酸的变性 核酸的复性 分子的杂交 核苷酸的酸性 核酸的性质—一般理化性质 核酸微溶于水，不溶于一般有机溶剂，常用乙醇作沉淀剂 核酸可被酸、碱或酶水解，可用层析、电泳等方法分离。 核酸的性质—紫外吸收性质 核酸中的嘌呤和嘧啶环在260-290nm紫外波段有很强的吸收，最大吸收峰在260nm附近，常用此性质来检测核酸 DNA和RNA的紫外吸收光谱差别不大 核酸的紫外吸收值比其各核苷酸的紫外吸收值之和少30~40%（减色效应）。 UV spectra of ribonucleotides 核酸的性质—结构稳定性 碱基对间的氢键 碱基堆积—碱基堆积力对维持核酸的空间结构起主要作用 环境中的正离子—环境中的Na+、K+、Mg2+、Mn2+等离子，可消除核酸中磷酸基间的静电斥力，对核酸结构的稳定有重要作用 核酸的性质—变性 变性的概念—核酸双螺旋区氢键断裂，空间结构被破坏，形成单链无规线团状态的过程。 热变性和Tm—DNA的稀盐溶液在加热下发生变性，在某一温度附近，260nm的吸光度骤然增加，其增加量达到最大增量一半时的温度称为熔解温度（Tm） 核酸的变性 核酸变性过程的紫外吸收 Tm时紫外吸收突变 影响Tm的因素 G-C对含量—G-C含量愈高， Tm 愈高 溶液的离子强度—离子强度低， Tm 较低 溶液的pH —pH11.3 时， DNA完全变性； pH5时， DNA易脱嘌呤 变性剂—甲酰胺、尿素和甲醛等可破坏氢键，妨碍碱基堆积，使Tm下降 Tm与具有不同G-C含量的生物 离子强度和G-C含量对Tm的影响 核酸的复性 复性—变性核酸的互补链在适当条件下重新缔合成双螺旋的过程。 变性核酸复性时需缓慢冷却， 故又称退火 Tm-25℃是较合适的复性温度 Denature and renature 影响复性的因素 单链片段浓度 单链片段长度 片段内的重复序列 溶液离子强度 分子杂交 分子杂交—不同来源的DNA互补区形成双链， 或DNA单链和RNA链的互补区形成DNA-RNA杂合双链的过程 分子杂交广泛应用于基因定位、确定生物的遗传进化关系等 分子杂交技术 Southern印迹法—将电泳分离后的DNA片段从凝胶转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上， 再进行杂交的技术 Northern印迹法—将电泳分离后的变性RNA吸印到纤维素膜上再进行分子杂交的技