第三章PCR与DNA测序.pptVIP

知识体系 PCR技术 引物设计软件 Primer Premier5.0 （自动搜索）* Oligo6 （引物评价） Vector NTI Suit DNAsis Omiga DNAstar Primer3 （在线服务） 四、PCR反应特点 第二节 常用的PCR衍生技术 1. 逆转录PCR （ reverse transcription PCR, RT-PCR） 5. 原位PCR SYBR荧光染料： 在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。 ③ Ct值与起始模板的关系 将DNA片段用荧光等分析仪，测出DNA序列碱基排列顺序。 DNA 序列测定方法： 1. Sanger的双脱氧法：A/T/G/C四个反应。 2.化学降解法：G反应；G+T反应；T+C反应和C反应。 3.自动测序法。 Sanger 小结 概念：Ct值 常规PCR技术的基本原理 定量PCR技术的基本原理 Sanger测序法的基本原理 TaqMan荧光探针： PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。 在PCR反应的退火过程中，荧光探针便会和模板杂交。进一步在PCR反应的延伸过程中， Taq酶的5’－3’外切酶活性可以分解与模板杂交的荧光探针，游离荧光物质发出荧光。 从而荧光监测系统可接收到荧光信号。即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 扩增曲线：4个阶段 ② Ct值（循环阈值，Cycle threshold）：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数 荧光域值（threshold）：PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：荧光信号开始由本底信号进入指数增长阶段的拐点时的荧光信号强度。 荧光阈值 循环次数 每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。 Part II DNA测序技术 DNA的测序是分子生物学研究中非常重要和关键的内容。对DNA一级结构的研究，有助于探索基因结构与功能、基因与疾病关系，进而推动生命科学研究获得质的飞跃。测定基因组的全部核苷酸序列、阅读和分析全部遗传信息，正是人类基因组计划（human genome project, HGP)的最主要目标之一。 DNA 测序的主要方法有两种，即双脱氧链终止法（Sanger 法、酶促法）和化学裂解法（Maxam-Gelbert 法）。二者均依赖于高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。不管是酶促法还是化学法，都是分为4个反应体系进行测序反应，寡核苷酸链分别终止于不同位置的A、T、G或C碱基。4种反应体系的寡核苷酸链产物，进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，放射自显影后，读出待测DNA的连续序列。 一、 Sanger 双脱氧链终止法 （一）原理(单链) DNA链中的核苷酸是以3`，5`-磷酸二酯键相连接，合成DNA所用的底物是2`-脱氧核苷三磷酸（dNTP），在Sanger 双脱氧链终止法中被掺入了2`，3`-双脱氧核苷三磷酸(ddNTP),当ddNTP位于链延伸末端时, 由于它没有3`- OH， 不能再与其它的脱氧核苷酸形成3′,5′-磷酸二酯键，DNA合成便在此处终止，如果此处掺入的是一个ddATP，则新生链的末端就是A，依次类推可以通过掺入ddTTP、 ddCTP、 ddGTP ，则新生链的末端为T、C或G，根据这个原理，Sanger与1977年建立了双脱氧链终止测序法。他本人也因此而获得了诺贝尔奖。 双脱氧核苷三磷酸 互补链合成过程 以单链或双链DNA为模板，采用DNA引物引导新生DNA的合成，因此又称为引物合成法，或酶促引物合成法。主要是基于DNA聚合酶的催化特性：①以DNA为模板，根据碱基配对的原则逐个将dNTP加到与模板结合的寡核苷酸引物的3′-OH末端，形成正确的模板DNA互补链；②能以dNTP作为底物，也能利用ddNTP作底物，将其掺入寡核苷酸链的3 ′末端而终止新生互补链的延伸。 如果在DNA的合成反应中，除了加入4种正常的脱氧核苷三磷酸（dNTP）外，再加入一种少量的2ˊ,3