免疫组化标准操作规程.docxVIP

石蜡切片免疫组化二步法操作规程 基于 DAKO Real Envision Detection Kit 65°C烤箱中烤片30min； 二甲苯脱蜡（共四缸，第一缸lOmin,后三缸涮过）； 梯度酒精脱苯（100%两缸，90%、80%、70%各一缸，依次涮过）； 自来水振洗； 去离子水浸洗1次； 抗原修复； PBS振洗三次； 3%过氧化氢-甲醇溶液室温孵育30min； PBS振洗三次； 10?一抗4°C孵育过夜； 11?PBS振洗三次； 滴加二抗聚合物，室温孵育30min； PBS振洗三次； 滴加DAB,显微镜下控制显色，去离子水终止显色，记录显色吋间; 自来水冲洗一次； 苏木素复染30sec； 自来水清洗一次； 盐酸酒精分化5sec； 自来水冲洗30min返蓝； 梯度酒精脱水（70%、80%、90%各一缸，100%两缸，依次涮过）； 二甲苯脱水（共三缸，前两缸涮过，第三缸5min）； 中性树胶封片。 石蜡切片免疫组化三步法操作规程 基于 DAKO LSAB2 System-HRP Detection Kit 65°C烤箱中烤片30min； 二甲苯脱蜡（共四缸，第一缸lOmin,后三缸涮过）； 梯度酒精脱苯（100%两缸，90%、80%、70%各一缸，依次涮过）； 自来水振洗； 去离子水浸洗1次； 抗原修复； PBS振洗三次； 3%过氧化氢-甲醇溶液室温孵育30min； PBS振洗三次； 切片置于湿盒中，滴加封闭血清（白色滴瓶装）室温封闭孵育30min； 甩去封闭血清（无需PBS清洗），滴加一抗4°C孵育过夜； PBS振洗三次； 13?滴加二抗（黄色滴瓶装），室温孵育30min； PBS振洗三次； 滴加HRP试剂（粉色滴瓶装），室温孵育30min； PBS振洗三次； 17?滴加DAB,显微镜下控制显色，去离子水终止显色，记录显色时间； 1自来水冲洗一次； 苏木素复染30sec； 自来水清洗一次； 盐酸酒精分化5sec； 自来水冲洗30min返蓝； 梯度酒精脱水（70%、80%、90%各一缸，100%两缸，依次涮过）; 二甲苯脱水（共三缸，前两缸涮过，第三缸5min）； 中性树胶封片。 抗原修复 （1） 抗原修复液： 1） PH6. 0柠檬酸缓冲液：商品化储存液，1:100稀释，200ml/框； 2） pH8. 0 Tris-EDTA缓冲液：商品化储存液,1:50稀释，200ml/框； 3） pH9.0 Tris-EDTA缓冲液：商品化储存液，1:50稀释，200ml/框; 4） 胰酶（Trypsin）修复液：商品化储存液，1:5稀释。 （2） 抗原修复法 1） 高压修复：电压力锅设定121°C, 5min,将切片置于抗原修复缓冲液中，放置于 压力锅内，保持泄气阀开放；启动电压力锅，待泄气孔有大量蒸汽喷出后，关闭 泄气阀；达到保温时间后电压力锅会自动停止，待温度降到80°C后，开盖取岀 切片，室温自然放凉。 2） 微波修复：抗原修复液置于塑料染色缸中，微波加热至沸腾；将切片置入染色缸 中，中火加热2分钟，关火保持加in,重复3次，室温自然放凉。 3）酶修复：切片置于湿盒中，每片滴加lOOul胰酶修复液，37°C孵育30mino 3%过氧化氢-甲醇溶液配制：取20ml过氧化氢原液（30%）,加180ml甲醇，配制 成3%过氧化氢-甲醇溶液200ml o DAB配制：DAB原液以稀释液按照1:50稀释，每片滴加50ulo PBS 配制（pH7. 2-7. 4, 0.01M 工作液）: 1） 5000ml： NaCl 42. 5g, Na2HP04. 12H20 14. 5g, NaH2P04. 2H20 1. 5g,力Q 400ml 去离 子水搅拌溶解，去离子水补足体积至5000ml； 2） 20000ml： NaCl 170g, Na2HPO4. 12H20 58g, NaH2PO4. 2H20 6g,加 400ml 去离子水 搅拌溶解，去离子水补足体积至20000ml；