第二章分子克隆3.pptVIP

基因工程 Genetic Engineering 李黄金 Email: lihuangjin@ 生命科学与生物制药学院 ２００9 基因工程概论 2.1 用于基因克隆的载体 细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome,BAC） 优点：能携带大片段DNA，约300kb 保留了与F 因子的自主复制、拷贝数控制以及质粒分配等基本功能相关的基因 2.1 用于基因克隆的载体 5‘粘性末端 3‘粘性末端 平端 同裂酶：识别位点与切割位点均相同的不同来源的酶 HindIII – HsuI: A / AGCTT 同尾酶：识别位点不同，但切出的ＤＮＡ片段具有相同 的末端序列 BglII：A / GATCT BamHI: G / GATCC 同尾酶的切割产物互为粘性末端，并能连接，但连接后二个酶的识别序列均被破坏。 5‘→3‘的核酸外切酶活性 待切除的核酸分子必须具有5‘端磷酸基团 核苷酸在被切除之前必须是已经配对的 被切除的核苷酸可以是脱氧的也可以是非脱氧的 四、DNA体外重组操作 3）DNA局部酶切消化 在基因文库构建中具有重要意义 DNA分子中只有部分限制位点被内切酶所切割而产生不完全消化的产物 可以通过缩短酶切消化反应的时间，降低反应的温度，减少酶用量来达到局部消化的目的. 提高重组率的策略 DNA酶切片段的连接策略 DNA的酶切操作策略 1、DNA酶切组合策略与操作 尽量采用双酶切片段重组 （基因插入方向确定） 尽量不要采用多克隆位点中紧邻的酶 不能采用外源基因内部有切点的酶 尽量采用同盐浓度要求的酶组合 尽量采用常用酶组合 尽量通过PCR引物设计优 化酶切组合 1）限切酶的盐浓度要求与操作 低盐酶：0 - 50 mM 中盐酶：100 mM 高盐酶：150 mM 限切酶活性对盐浓度高度敏感，据盐浓度要求分三类： 多酶联合酶解时的策略 A、对盐浓度要求相同的酶可以同时酶切 5‘ …GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’ 3‘ …CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’ BamHI SmaI 5‘ …GCTACATG GATCCCGGGTTCGCAT…3’ 3‘ …CGATGTACCTAG GGCCCAAGCGTA…5’ 5‘ …GCTACATGGATCCC GGGTTCGCAT…3’ 3‘ …CGATGTACCTAGGG CCCAAGCGTA…5’ 但应注意：紧密相连时难切割 B、对盐浓度要求不同的酶，可采取下列策略： 使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解 低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切 一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切 0.1倍体积的 5 M NaAc pH 5.4 2.5倍体积的冰冷乙醇 冰浴 5 分钟、高速冷冻离心10分钟、干燥 2）DNA样品纯度要求与操作 待酶切DNA样品必须达到较高纯度，样品中的蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等杂质过多抑制酶活性。 策略： 加大酶的用量 加大反应总体积 延长反应时间 2、DNA连接策略与操作 一粘一平末端的连接（简单） 单酶切粘性末端的连接 双酶切粘性末端的连接（简单） 平端的连接 不匹配末端的连接 1）单酶切粘性末端的连接：载体5‘端用碱性磷酸酯酶去磷 酸化防自环 5 5 GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG EcoRI 5 G CTTAA AATTC G 5 5 G CTTAA 5 5 AATTC G 5 退火 G CTTAA AATTC G 5 G CTTAA 5 AATTC G G CTTAA AATTC G 5 G CTTAA 5 AATTC G T4-DNA ligase GAATTC CTTAAG 5 5 GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG 5 5 GAATTC CTTAAG 外源片段有2个插入方向 外源片段 载体 2）同尾酶生产的粘性末端的连接 BamHI 5 5 GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG 5 G CCTAG GATCC G 5 5 T ACTAG 5 5 GATCA T