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第二章 基因工程的主要技术原理 2、Northern blot 2. 构建基因文库的载体选用 3. 基因文库构建的一般步骤 （2）载体与基因组DNA大片段的连接 4. 基因组文库的大小 二、 cDNA文库的构建 4. 构建cDNA文库的一般步骤 （2）mRNA的分离纯化 （3）cDNA的合成 ② 降解mRNA模板 ③ cDNA第二链合成 ④去掉发卡结构 妙用RNaseH 5.cDNA与载体连接： 6. cDNA文库的大小 第六节 酵母双杂交系统 一、酵母双杂交系统的作用 2. 拆开 Domain 3. 重组Domain （1）如果蛋白A与蛋白B不能相互结合 （2）如果蛋白A与蛋白B能相互结合 双杂交原理 三、构建双杂交体系的宿主菌 五、构建双杂交体系的穿梭质粒 （1）BD-plasmid （2）AD-plasmid 六、酵母双杂交的实验过程 （1）存活选择 （2）蛋白结合选择 在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。 或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’端分别加上几个C或G，成为粘性末端。 接上人工接头 粘性末端 CCC CCC 末端转移酶 一个cDNA文库要包含99%的mRNA时所需要的克隆数目。 N= ln (1-p) ln (1- ) p: 文库包含了完整mRNA的概率（99%） : 某一种低丰度（不足14份拷贝）mRNA占细胞整个mRNA的比例 N：所需的重组载体数（克隆数） 1 n 1 n Yeast Two Hybrid System (Interaction trap) 90年代，纽约大学的S. Field等建立。 有效地分离能与一种已知的靶蛋白相互作用的蛋白质 二、酵母双杂交系统的原理 许多真核生物的转录激活因子都是由两个在结构上可以分开的、功能上也相互独立的结构域组成。 1. 结构域（Domain）合作 例如： 啤酒酵母的半乳糖苷酶基因激活因子GAL4: DNA binding domain Active domain N C 1-147aa 768-881aa 上游激活序列（UAS） 转录机 GAL4效应基因 结合 结合 激活转录 只要DNA binding domain（DNA-BD）与Active domain（AD）靠近就能够表现转录激活活性。 实验发现： 转录表达 DNA binding domain Active domain 上游激活序列（UAS） 转录机 GAL4效应基因 结合 用重组DNA技术把GAL4的两个Domain分开，就丧失了激活效应基因的能力。 不能转录 用重组DNA技术把这两个Domain分别与两个不同的多肽连接。 Active domain 蛋白A 蛋白B DNA binding domain 在体内，蛋白A与蛋白B是否能结合。 通过效应基因是否被激活来检查： 4. 观察报告基因表达 上游激活序列（UAS） 转录机 GAL4效应基因 蛋白A DNA binding domain 转录激活domain 蛋白B GAL4的DB domain与AD Domain也不能靠近，所以仍然不能启动效应基因的转录。 不能转录 上游激活序列（UAS） 转录机 GAL4效应基因 蛋白A DNA binding domain 转录激活domain 蛋白B 激活转录 GAL4的DB domain与AD Domain也能靠近，所以能启动效应基因的转录。 转录表达 X基因和Y基因产物的相互结合，导致reporter gene表达。 Reporter gene表达就可说明X基因产物与Y基因产物能结合。 删除基因组中的内源野生型GAL4基因 使酵母菌只能利用载体表达的GAL4蛋白。 如： SFY526; HF7c等菌株。 四、构建报告基因（reporter gene） GAL4激活组氨酸合成酶的表达，使酵母菌能生长在组氨酸缺乏培养基上。 GAL4的效应基因是his3/lacZ/URA3。 此外还有其他营养缺陷。 1. 穿梭质粒（shuttle plasmid） 既能在大肠杆菌中复制，又能在酵母菌中复制和表达的质粒。 2. 双杂交体系需要两种穿梭质粒 分别携带已知的靶蛋白基因和携带未知基因序列。 靶基因按正确的读码结构和取向克隆在GAL4的BD之后。 P: ADH1启动子。 T: ADH1终止子。 筛选标志：TRP 核定位信号是GAL4本身的一部分 ADH：Alcohol dehydrogenase 外源基因按正确阅读框克隆到GAL4的AD片断之后。 P: ADHI启动子。 T: ADHI终止子。 筛选标志：LEU2 核定位信号是SV40的T抗原的序列 1. 把蛋白A插入到BD质粒上（pGBT9） 2. 把蛋白B插入到AD质粒上（pGAD424） 3. 两种