课题3　血红蛋白的提取和分离.pptxVIP

课题3 血红蛋白的提取和分离;一、基础知识---蛋白质分离和提取的原理;分子量;4、具体过程;1、概??：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。;3、缓冲溶液的配制;（三） 电泳：;; 4、聚丙稀酰胺凝胶电泳;SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。;;血液;（一）样品处理;分离血红蛋白溶液;透析过程动画演示;（二）凝胶色谱操作---纯化;2、凝胶色谱柱的装填;装配好的凝胶柱;3、样品加入与洗脱---调节缓冲液面→加入蛋白质样品→调节缓冲液面→洗脱→收集分装蛋白质;收集得到的纯化后的蛋白;三、SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳; 观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。; 如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。;（1）计算：根据色谱柱的内体积计算所需凝胶量 （2）凝胶溶胀：凝胶浸泡于蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液 （3）固定：将色谱柱装置固定在支架上 （4）装填：将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。 （5）洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时。 装填时注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。 洗涤平衡时注意：1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。 ;4、用SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的方法