北京大学生物显微镜课件.pptVIP

尼科尔棱镜 用途 用于研究组织晶体物质及纤维等的光学性质 微分干涉显微镜 无色透明活体标本的细微结构 图象呈浮雕状的立体感 观察效果更加逼真 1 原理 通过特制的棱镜将偏振光分解相互垂直，强度相等的光束，光束载极近的两点（小于显微镜的分辨率）上通过被检物体，从而在相位上略有差别，使图象呈现出立体三维感觉。 2 特点 可以使被检物体产生三维立体感觉 观察效果更直观 无须特殊物镜，与荧光观察配合更好 可以调节背景和物体的颜色变化而达到理想的效果。 三、荧光显微镜 一、原理 荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光(如紫外光3650入或紫蓝光4200入)作为激发光、激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜的放大进行观察。这样在强烈的对衬背景下，即使荧光很微弱也易辨认，敏感性高，主要用于细胞结构和功能以及化学成分等的研究。 荧光显微镜的基本构造是由普通光学显微镜加上一些附件(如荧光光源、激发滤片、双色束分离器和阻断滤片等)的基础上组成的。 什么是荧光：物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光，是非温度辐射光——冷光。即：物质吸收短波光，发射出的长波光。 显微镜荧光利用光源激发——光化荧光 荧光的种类： 自发荧光（固有荧光） 二次荧光 荧光的性质： 吸收光，必需有激发光源 荧光波长＞激发波长（损失热能） 荧光强度极小于激发光的强度 有不同程度的衰减 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率 二、荧光显微镜的种类： 透射式 落射式 三、荧光显微镜主要部件 透射式 汞灯光源 激发滤色镜 吸收滤色镜 暗场聚光镜 落射式 汞灯光源 激发滤色镜 分色镜 吸收滤色镜 荧光显微镜内部构造 落射荧光显微镜光路图 透射荧光显微镜光路图 WU WIB DUAL BAND WIBA WIG WIB DAPI+FITC FITC+PI 双重染色标本的单色和双色观察 荧光光源 一般采用超高压汞灯(50一200W)，它可发出各种波长的光，但每种荧光物质都有一个产生最强荧光的激发光波长，所以需加用激发滤片（一般有紫外、紫色、蓝色和绿色激发滤片），仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其他光都吸收掉。 每种物质被激发光照射后，在极短时间内发射出较照射波长更长的可见荧光。荧光具有专一性，一般都比激发光弱，为能观察到专一的荧光，在物镜后面需加阻断滤光片。它的作用有二：一是吸收和阻挡激发光进入目镜、以免干扰荧光和损伤眼睛。二是选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。两种滤光片必须选择配合使用。 四、使用方法． 1．打开灯源，超高压汞灯要预热几分钟才能达到最亮点。 2．透射式荧光显微镜需在灯源与聚光器之间装上所要求的激发滤片，在物镜的后面装上相应的阻断滤片。 落射式荧光显微镜需在光路的插槽中插入所要求的激发滤片／双色束分离器／阻断滤片的插块。 3．放置标本片，调焦后即可观察。 使用中应注意：末装滤光片不要用眼直接观察，以免引起眼的损伤； 4．高压汞灯关闭后不能立即重新打开，需经5分钟后才能再启动，否则会不稳定，影响汞灯寿命。 五、用途 1 观察标本中的自发荧光物质或以荧光素染色或标记的细胞和结构 2 标本中的荧光物质在紫外线激发下产生各种颜色的荧光，借以研究该荧光物质在细胞和组织内的分布。组织中的自发性荧光物质如神经细胞和心肌细胞等内的脂褐素呈棕黄色荧光，肝贮脂细胞和视网膜色素上皮细胞内的维生素A呈绿色荧光，某些神经内分泌细胞和神经纤维内的单胺类物质（儿茶酚胺、5－羟色胺、组胺等）在甲醛作用下呈不同颜色的荧光，组织内含有的奎宁、四环素等药物也呈现一定的荧光。 3 细胞内的某些成分可与荧光素结合而显荧光，如溴化乙锭与吖啶橙可与DNA综合，进行细胞内DNA含量测定。 4 荧光显微镜更广泛用于免疫细胞化学研究，即以异硫氰酸或罗丹明等荧光素标记抗体（一抗或二抗），用该标记抗体直接或间接地与细胞内的相应抗原结合，以检测该抗原的存在与分布。 激光扫描共焦显微镜技术 工作原理：激光扫描显微镜是建立在光学显微镜及各种扫描显微镜基础上的一种新型的扫描成象系统。利用聚焦的激光束在样品表面扫描，同时利用光电检测器件接收样品反射光（或透射光），样品结构的变化使反射光（或透射光）强度改变，因而使光电检测器的输出电流改变，经信号处理，同步显示在计算机屏幕上。 共焦显微镜与传统显微镜的区别 1.抑制图像的模糊，获得清晰的图像 2. 具有更高的轴向分辨率，并可获取连续光学切片 3. 增加侧向分辨率 4. 由于点对点扫描去除了杂散光的影响 激光扫描共焦显微