血凝HA和血凝抑制试验HI介绍课件.pptVIP

血凝(HA)和血凝抑制试验(HI)介绍;主要内容;一、基本概念;;;;;;;;二、HA和HI实验在禽病诊断中的作用;2、HI试验可用于发病禽群的诊断 鸡、鸭、鹅规模化养殖中虽进行相关疫病疫苗的免疫，但往往有部分家禽由于各种原因免疫力水平达不到要求，因而造成某些传染病的流行。由于免疫禽群发病时临床症状和病变不典型，给确诊带来困难。采用HI试验对鸡群中禽流感、新城疫等抗体进行测定，依据抗体滴度的高低和离散性有助于诊断。 例如：经新城疫活苗加灭活苗免疫过的鸡群，新城疫抗体水平平均为7Log2???8Log2，最高为10Log2。而新城疫感染鸡群中HI抗体部分高达11Log2～13Log2；就抗体分布而言，鸡新城疫免疫鸡群抗体水平呈正态分布，HI抗体在10Log2以上者仅占10％以下，4Log2以下者在1％以下。而感染了新城疫强毒并出现发病的鸡群，HI抗体中10Log2以上者占25％以上，而4oLg2以下者在10％～30％之间。因此，依据禽群的抗体水平高低和分布，结合临床症状和病、死鸡的剖检变化，可诊断禽群是否患有新城疫或禽流感等。 ;3、对禽群的免疫状态进行评价 禽群或个体血清中的HI抗体水平与疫苗的免疫和对相应强毒侵袭的抵抗力都有密切关系。以新城疫为例，当HI抗体在7Log2以上进行活苗免疫时，由于高抗体可中和绝大部分的疫苗病毒，产生的免疫力很弱；HI抗体在5Log2～6Log2时，活苗免疫效果也受到一定的干扰；当HI抗体在4Log2以下时，活苗免疫效果良好，但对强毒感染抵抗力下降。一般认为，成年鸡新城疫的HI抗体水平在5Log2以上时，保护率在90％以上，4Log2以下时只有50％的鸡对强毒有抵抗力，2Log2以下时80％以上的鸡易感染新城疫。 由于雏鸡母源抗体对疫苗首次免疫效果影响很大，了解母源抗体水平对疫苗免疫有重要意义。研究表明，母鸡血清抗体、卵黄抗体和5日龄雏鸡母源抗体三者之间有相关性，卵黄抗体与母鸡血清抗体基本一致，而1日龄雏鸡血清抗体低于卵黄抗体一个滴度，可检测种鸡卵黄抗体、估测1日龄雏鸡母源抗体水平。 雏鸡新城疫母源抗体半衰期约为5天，免疫临界点为3Log2，这样可依据抗体水平，确定最佳免疫时间。 ;三、实验步骤（以禽流感为例，参照禽流感防治技术规范） ;2 1%鸡红细胞液的制备 2.1采血 用注射器吸取阿氏液约1mL，取至少2只SPF鸡（如果没有SPF鸡，可用常规试验证明体内无禽流感和新城疫抗体的鸡），采血约2～4mL，与阿氏液混合，放入装10mL阿氏液的离心管中混匀。 2.2 洗涤鸡红细胞 将离心管中的血液经1500～1800 r/min 离心8分钟，弃上清液，沉淀物加入阿氏液，轻轻混合，再经1500～1800 r/min离心8分钟，用吸管移去上清液及沉淀红细胞上层的白细胞薄膜，再重复2次以上过程后，加入阿氏液20 mL，轻轻混合成红细胞悬液，4℃保存备用，不超过5天。 2.3 10%鸡红细胞悬液 取阿氏液保存不超过5天的红细胞，在锥形刻度离心管中离心1500～1800 r/min 8分钟，弃去上清液，准确观察刻度离心管中红细胞体积(mL)，加入9倍体积(mL)的PBS，用吸管反复吹吸使PBS与红细胞混合均匀。 2.4 1%鸡红细胞液 取混合均匀的10%鸡红细胞悬液1 mL，加入9 mLPBS，混合均匀即可。 ;3 抗原血凝效价测定（HA试验，微量法） 3.1 在微量反应板的1孔～12孔均加入25μLPBS，换滴头。 3.2吸取25μL病毒悬液加入第l孔，混匀。 3.3从第1孔吸取25μL病毒液加入第2孔，混匀后吸取25μL加入第3孔，如此进行对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取25μL弃之，换滴头。 3.4每孔再加入25μL PBS。 3.5每孔均加入25μL体积分数为1%鸡红细胞悬液（将鸡红细胞悬液充分摇匀后加入） 3.6振荡混匀，在室温（20～25℃）下静置40min后观察结果（如果环境温度太高，可置4℃环境下反应1小时）。对照孔红细胞将呈明显的钮扣状沉到孔底。; ;4、血凝抑制试验（HI试验 微量法） 4.1 根据3的试验结果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以4即为含4HAU的抗原的稀释倍数。例如，如果血凝的终点滴度为1:256，则4HAU抗原的稀释倍数应是1:64（256除以4）。 4.2 在微量反应板的1孔～11孔加入25μL PBS，第12孔加入50μL PBS。 4.3 吸取25μL血清加入第1孔内，充分混匀后吸25μL于第2孔，依次对倍稀释至第10孔，从第10孔吸取25μL弃去。 4.4 1孔～11孔均加入含4HAU混匀的病毒抗原液25μL，室温（约20℃）静置至少30min。 4.5 每孔加入25μL体积分数为1%的鸡红细胞悬