植物组织培养基本方法.ppt

植物组织培养的基本方法 目的要求 1．一般掌握灭菌和消毒的区别　 2．掌握灭菌的方法和具体操作过程 3．掌握无菌接种的步骤 　 4．掌握外植体的选择、培养方法和步骤 5．一般掌握外植体褐变和玻璃化的处理方法 6．掌握试管苗驯化的基本程序 7．一般掌握快速繁殖试管苗的计划安排及增殖倍数计算方法 灭菌 灭菌是组织培养重要的工作之一。初学者首先要清楚有菌和无菌的范畴。 这里所指的菌，包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其它微生物。 灭菌是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死。 消毒，它指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用，显然经过消毒，许多细菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不会完全杀死，即消毒后的环境里、物品上还有活着的微生物。 而通过严格灭菌的操作空间（接种室、超净台、等）和使用的器皿，以及操作者的衣着和手都不带任何活着的微生物。在这样的条件下进行操作，就叫做无菌操作。 常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类。 物理方法如干热（烘烧和灼烧）、湿热（常压或高压蒸煮）、射线处理（超声波、微波）、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施。 化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。 这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用。 1．培养基用湿热灭菌 培养基在制备后的24小时内完成灭菌工序 按容器大小不同，保压时间有所不同（下表）。 2. 用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌 在无菌操作时，把镊子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒精灯火焰上灼烧灭菌。冷却后，立即使用。操作中可采用250或500ml的广口瓶，放入95%的酒精，以便插入工具。 3.玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌 干热灭菌是利用烘箱加热到160～180℃的温度来杀死微生物。通常采用170 ℃持续90分钟来灭菌。 4. 不耐热的物质采用过滤灭菌 一些生长调节剂，如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素是不耐热的，不能用高压灭菌处理，通常采用过滤灭菌方法-防细菌滤膜 。 5.空间采用紫外线和熏蒸灭菌 （1）紫外线灭菌 在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。紫外线灭菌是利用辐射因子灭菌。细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化，引起细菌的染色体变异，造成死亡。紫外线的波长为200～300nm，其中以260nm的杀菌能力最强，但是紫外线的穿透物质的能力很弱，所以只适于空气和物体表面的灭菌，且要求距照射物以不超过1.2米为宜。 （2）熏蒸灭菌 用加热焚烧、氧化等方法 ，使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以杀死空气和物体表面的微生物。这种方法简便，只需要把消毒的空间关闭紧密即可。升汞与高锰酸钾，常用熏蒸剂是甲醛 。 6.一些物体表面用药剂喷雾灭菌 物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。如桌面、墙面、双手表面、植物材料表面等。可用70％的酒精反复涂擦灭菌，１％～２％的来苏儿溶液以及0.25～１％的新洁尔灭也可以。 7. 植物材料表面用消毒剂灭菌 外植体的选择: 外植体部位：不同植物以及同一植物的不同器官对诱导条件的反应不一样； 取材季节：大多数植物应该在生长开始的时候采集； 器官的生理状态和发育年龄：幼年组织比老年组织具有较高的形态发生能力； 外植体大小：茎尖培养中，外植体越小成活率越低。 外植体的灭菌方法: 植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接到培养基上，这一过程叫做接种。接种的植物材料叫做外植体。 首先，将采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔细洗干净，如用适当的刷子等刷洗，硬的材料用刮刀刮。 第二步是对材料的表面浸润灭菌。 第三步是用灭菌剂处理。 最后一步是用无菌水涮洗，涮洗要每次3分钟左右，视采用的消毒液种类，涮洗3～10次左右。 常用的消毒剂：既要考虑具有良好的消毒、杀菌作用，同时又易被蒸馏水冲洗掉或分解掉；应当正确选择消毒液的浓度和处理时间，应尽量减少组织的死亡；一些表面消毒剂的消毒效果不相同。 接 种 接种前后的程序： A：接种室消毒：用酒精擦拭台面，接种工具摆放好后用紫外灯照射表面灭菌15-20分钟，然后通风20分钟； B：手要洗净，用75%酒精擦手，在操作过程中要经常用酒精擦手； C：将初步洗涤及切割的材料放入烧杯（烧杯用75%酒精擦杯壁），带入超净台上，用消毒剂灭菌，再用无菌水冲洗．最后沥去水分，取出放置在灭过菌的４层纱布上或滤纸上。 D：材料吸干后，一手拿镊子，一手拿剪子或解剖刀，对材料进行适当的切割。 E：用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。 培养 培养：指把培养材料放在培养室（有光照、温度条件）里，使之生长，分裂、分化形成愈伤