第一章生物化学检测技术.ppt

生物检测技术 内容 主要由六个模块构成： 生物化学检测技术 免疫学检测技术 细胞学检测技术 分子生物学检测技术 微生物学检测技术 生物检测仪器 第一章 生物化学检测技术 内容 第一节电泳技术 第二节光谱分析技术 第三节生物大分子含量测定 第四节色谱分析技术 第五节干化学分析技术 目标 掌握琼脂糖电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和操作要点。 掌握可见光和紫外光的分光光度技术的原理和方法。 理解各种蛋白质含量测定技术的原理和优缺点。 理解各种核酸含量测定技术的原理和优缺点。 第一节 电泳检测技术 电泳：带电质点在电场中移动的现象。 1809年由俄国人发现。 1937年瑞典科学家Tiselius建立了“移界电泳法”，成功地分离血清蛋白质各成分。 50年代，改进电泳仪，寻找合适的电泳支持介质，先后找到滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀粉及琼脂作为支持物。 60年代，找到聚丙烯酰胺凝胶作为电泳支持物，在此基础上发展了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳和印迹转移电泳等技术。这些技术具有设备简单，操作方便，分辨率高等优点。 目前，电泳技术已成为生物化学与分子生物学以及与其密切相关学科分析中必不可少的手段。 从实际和实用出发的分类 根据分离样品样品的数量和目的分制备和分析电泳 根据结合配套的技术分免疫、层析、等电聚焦、转移、双向、脉冲梯度电场、垂直交替凝胶电泳等 根据使用电压分常压（＜500）和高压电泳。 根据电泳系统pH连续与否分连续和不连续pH电泳 根据介质使用与否分自由和区带电泳（滤纸、薄层、凝胶电泳） 根据电泳槽的形式分有 垂直的、水平的、柱状的、板状的、毛细管的、湿小室及幕状的。 毛细管电泳是20世纪80年代研制出的一种新型的区带电泳方法，具有分辨率好、灵敏度高、检测快捷等特点。 一、琼脂糖凝胶电泳 1、原理：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因而就可依据DNA分子的大小使其分离。该过程可以通过把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。 DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。 2、操作方法 试剂与设备 制胶： 称干粉，融化，倒胶，插梳子，凝固，装电泳槽。 3、步骤 ⑴ 1g 琼脂糖加入100ml 1×TAE电泳缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。（冷却到60℃，加入100μl的0.5mg/ml EB，并摇匀。） ⑵ 用胶带将制胶板两端封好，插入适当梳子，将溶解的琼脂糖（约50℃）倒入，室温冷却凝固。 ⑶ 充分凝固后撕掉两端的胶布，将凝胶置入电泳槽中，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。 ⑷ 用移液器吸取总DNA或质粒样品4μl于封口膜上，再加入2μl 的6X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。 ⑸ 打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min-60min。 ⑹ 将凝胶放入EB染液中染色5-10min,用清水稍微漂洗。 ⑺ 将染色后的凝胶置于紫外透射检测仪上，盖上防护观察罩，打开紫外灯，可见到发出荧光的DNA条带。 4、影响因素 1）琼脂糖 来源，纯度。酸根取代导致Agarose带电。 对支持物的一般要求是均匀，吸附力和电渗小，机械性能好，便于染色或紫外光下检测，故最好透明，无紫外吸收。常用的支持物有滤纸，醋酸纤维素薄膜，淀粉凝胶，聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖凝胶等。支持物性质不同也会影响泳动速率，如琼脂于聚丙烯酰胺凝胶都有大小不同的筛孔，在筛孔大的凝胶中溶质颗粒的泳动速率快，反之则慢。 2）胶浓度 2、试剂设备 试剂: 5 X MOPS电泳缓冲液：20.9g MOPS (0.1mol/L), pH7.0; 8.3ml 3mol/L NaAC(40mmol/L); 10.0ml 0.5mol/L EDTA (5mmol/L) pH8.0, 用水定容至1L. 以上药品和水均需用DEPC处理。 10 x甲醛上样缓冲液：1mmol/L EDTA, pH8.0; 0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯蓝，50%甘油). 37% 甲醛（pH 大于4.0，12.3mol/L）; 甲酰胺; 10mg/ml溴化乙锭. 以上药品和水均需用DEPC处理。 3、步骤 胶的制备：1.5g琼脂糖加115ml水，加热融化。冷却至60℃时加30ml的5 X MOPS电泳缓冲液 (终浓度为1X); 加5ml甲醛（琼脂糖终浓度为1