基因克隆载体和受体.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 载体功能分类： ①克隆载体 ②穿梭载体 ③表达载体 （1）克隆载体：以繁殖外源DNA片段为目的载体通称为克隆载体。 克隆载体按来源分： ①质粒载体 ②噬菌体载体 ③酵母人工染色体载体 ④病毒载体。 （2）穿梭载体： 双宿主载体，可在两种不同宿主中复制的载体，细菌到细胞，细菌到真核细胞等。 （3）表达载体： 是用来将克隆的外源基因在宿主细胞内表达蛋白质的载体，有很强的启动子和终止子。 第五节 基因打靶载体（Targeting vector） 通过DNA同源重组，使细胞特定的内源基因被破坏而造成其功能丧失或在基因组特定的位点插入外源基因。 一、基因打靶（gene targeting） 基因敲出（knock-out） 基因敲入（knock-in） 二、基因打靶载体的要求 1. 要求能整合到染色体上特定的位置。 2. 整合的位置尽量选在基因组内编码非必需产物的地方。 3. 必需整合在基因组中可以转录的区域。 定点整合 1. 两段同源DNA序列（HB1和HB2） 2. 目的基因 三、基因打靶载体组成 3. 编码抗G418的基因（neor） 4. 胸苷激酶基因（HSV-tk1和HSV-tk2） 与靶位点两端的区域同源 新霉素（neomycin）磷酸转移酶基因 分别来自I型和II型单纯疱疹病毒（HSV）。 载体 tk1 HB1 neor 目的基因 HB2 tk2 载体 四、载体的整合方式 染色体DNA HB1 染色体DNA HB2 染色体DNA 载体 tk1 HB1 neor 目的基因 HB2 tk2 载体 染色体 tk1 HB1 neor 目的基因 HB2 tk2 染色体 两个tk基因至少有一个可能整合到基因组里。细胞被tk基因杀死。 1. 非特异整合——非同源重组 2.特异位点整合——同源重组 载体 tk1 HB1 neor 目的基因 HB2 tk2 载体 HB1 neor 目的基因 HB2 染色体DNA HB1 染色体DNA HB2 染色体DNA 染色体DNA 染色体DNA 只有目的基因和neor基因整合进去，tk基因不会整合。细胞在G418中存活。 五、转染细胞的选择 正-负选择法： 1. 正选择（positive selection）： 用G418进行选择。 没有整合进neor基因的细胞都被杀死。 2. 负选择（negative selection）： 用9-鸟嘌呤（ganciclovir，GCV）。 表达胸苷激酶（tk）的细胞都被杀死（Tk能把GCV转化成有毒的化合物）。 各种基因工程受体的特性 实验室常用的基因工程受体 受体细胞应具备的条件 第六节 用于基因转移的受体菌或细胞 受体细胞应具备的条件 限制性缺陷型 外切酶和内切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-） 重组整合缺陷型 用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA-） 具有较高的转化效率 具有与载体选择标记互补的表型 感染寄生缺陷型 防止重组细菌扩散污染，生物武器除外 各种基因工程受体的特性 大肠杆菌 遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子稳定 适用于外源DNA的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达、基因文库的构建，是DNA重组实验和基因工程的主要受体菌 生产出结构复杂、种类繁多的内毒素 各种基因工程受体的特性 枯草杆菌 遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全 ，生长迅速，培养简单，不产内毒素 适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的有效分泌 遗传欠稳定，载体受体系统欠完备 各种基因工程受体的特性 链霉菌 抗生素的主要生产者，分子遗传相对操作简便，不产内毒素 主要用于抗生素生产菌株的改良 遗传不稳定，生长相对缓慢 各种基因工程受体的特性 酵母菌