第三章 基因工程载体.ppt

2）Charon40 Charon40的可置换片断是由DNA短片重复构成，片断之间有Hae I 切点。 在克隆的时候，可以用Hae I 酶进一步将可置换片断切成小片断，以防止重新与载体连接。 左臂 可置换区 右臂 MCS MCS Charon40 Hae I 可取代片断中如果包含LacZ’，可用Xgal显色作筛选标记。 （4）?载体的筛选标记 ② 插入型载体 根据插入所引起的表型突变。 ① 置换型载体 ?载体克隆策略 置换型载体 ? DNA象质粒载体那样直接转化细菌时效率远比质粒低。 5. ?载体的体外包装 在试管中与?噬菌体的头部和尾部蛋白人工装配成噬菌体颗粒，才能高效地感染细菌，把重组DNA注入受体菌中。 必须利用噬菌体外壳的作用！ （1）体外包装： （4）pBluescript 噬菌粒载体（pBS） Stratagene公司发展的一类噬菌粒载体。 由pUC质粒载体、f1噬菌体的复制起点和T3、T7噬菌体的启动子组成。 ② 特点 ① 组成 MCS两侧分别加上T3和T7噬菌体的启动子。加入适当的噬菌体RNA聚合酶，就可以定向体外转录。 1）定向体外转录 2）两种复制模式 既能以质粒的形式复制，又能以噬菌体的形式复制包装。 3）选择方便 有Ampr和lacZ’，可以进行Amp抗性选择和Xgal-IPTG蓝白斑选择。 4）插入方便 18个单一酶切位点的MCS SK：表示lacZ’的转录方向是沿MCS上的 SacI ? KpnI +（f1+）：单链复制起始方向背离 lacZ’，能回收lacZ’的编码链（+） pBluescript SK（+/-）/pBluescript KS（+/-） KS：反向（ KpnI ? SacI ，MCS相反） -（f1-）：能回收lacZ’的非编码链（-） 1）pBluescript SK/KS（+/-）区分： ③ 常用的 pBluescript 载体 pBS SK+ pBS KS- （5）PCR产物克隆载体 T 载体 pCR系列载体 Invitrogen公司开发的线性噬菌粒载体。 ① 结构 pUC的质粒部分、fi噬菌体ori、Kanr和Ampr抗性。 MCS的中部已经切开，各有一个3’端突出的T。 ② 特点 PCR产物往往在3’端突出一个A，所以能与这个载体直接连接。 pCR2.1 pCR2.1的MCS 克隆的PCR产物能被两侧的EcoRI切下来回收。 pCR2.1-topo pCR1000 Promega 公司的T载体系列 pGEM-T vector pTarget vector G418抗性 可在真核生物表达 外显子捕捉 T vector的克隆过程——简便！ A A T T T vector PCR product T4 DNA ligase A A 7. 噬菌体展示载体（ Phage display vector） （1）噬菌体展示（Phage display） 将外源蛋白（多肽、酶、抗体、DNA结合蛋白）结合到噬菌体的外壳蛋白上形成融合蛋白，表达于噬菌体的外表面。 G. P. Smith1985年发明。 丝状噬菌体（M13、f1等）外壳颗粒的一端，有3-5个基因Ⅲ编码的蛋白质（g3p），在识别和吸附大肠杆菌的过程中起作用。 M13 （2）噬菌体展示载体的构建 把外源DNA片断插入基因Ⅲ的序列前端，并保持两者的阅读框正确，表达出融合蛋白。 启动子 外源DNA M13基因Ⅲ ori M13 display vector 外源多肽 四、双链噬菌体载体—?载体 （1）长度为48502 bp； （2）双链线性DNA； （3）但在两端有cos位点，可以环化。 ?DNA两端各有12bp的粘性末端，粘性末端形成的双链区域称为cos位点。 1. ?DNA分子的特点 cos位点（cohensive-end site）： ?DNA进入细菌体内后，可形成双链环状DNA复制型（RF DNA）。 ?噬菌体和其DNA DNA上有至少61个基因，有一半是必须的，与自身的活动有关，成簇排列。 其他约1/3是非必须基因（位于尾部合成至阻遏之间的区段）。 2. ?噬菌体的基因组特点 ? genome(48502bp) ?噬菌体感染细菌的早期：双链进行?型复制。 3. ?DNA的复制 模型 （1） ?型复制 （2）滚环复制 感染的晚期：启动滚环复制机制。 形成多联体?DAN分子。 这种多联体分子必须在cos位点被切断成单体分子才能被包装起来。 （1）构建原理： 4. ?噬菌体载体的构建 （2）构建过程 ①在这个非必须区内制造限制酶切点 ②引进某些突变表型，作为选择标记 ③突变某些基因，使它成为安全载体 ④删除?DNA必须区段上常用