大学讲义常用分子生物学技术应用基本原理与应用.ppt

GST pull-down assay 与Co-immumoprecipitation 联合应用举例 （三）酵母双杂交技术（yeast two-hybrid system） 酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能通过报告基因的表达产物敏感地检测得到。 它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。 该技术既可用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的相互作用，也可用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的相互作用。 1989年美国纽约州立大学的Fields和Song首先描述了酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system)。 1 酵母双杂交系统的建立 该系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。 真核生物基因转录需要反式转录激活因子的参与， 真核生物转录因子含有两个不同的结构域： 转录激活因子 DNA结合结构域(BD) (DNA binding domain) 转录激活结构域(AD) (activation domain) 这两个结构域各具功能，互不影响, 单独存在时没有转录激活的功能，只有两者通过共价或非共价键连接建立起来的空间结构方可表现出一个完整的激活特定基因表达的激活因子的功能。 Gal4为酵母半乳糖苷酶基因gal1的转录激活因子，天然的Gal4分子是由一条由881个氨基酸残基组成的多肽链。 两个结构域中的DNA-BD由位于N-末端的1～147位多肽构成，能识别位于Gal4效应基因的上游激活序列(upstream activation sequence，UAS)。此外，在其N-端还具有一段核定位序列。AD由位于C-末端的768～881位多肽构成。 当Gal4的两个结构域位于不同肽链上，只要它们在空间上充分接近，则能恢复Gal4作为转录因子的活性。 Fields和Song将两个融合蛋白分别构建在穿梭质粒上，一个是将Gal4的DNA-BD与酵母蛋白SNF1融合；另一个是将Gal4的AD和酵母蛋白SNF4融合。 其中，SNF1是一种丝氨酸/苏氨酸的蛋白激酶，SNF4是它的一个结合蛋白，这两种蛋白是已知可以相互作用的。 当两种穿梭质粒共转化含有Gal4结合位点的报告基因LacZ的酵母菌株后，通过SNFl与SNF4的相互作用，Gal4的DNA-BD与Gal4的AD靠近, 形成一个大的复合物Gal4BD-SNF1-SNF4-Gal4-AD。 Gal4的DNA-BD可识别位于Gal4效应基因的UAS，并可与之结合； Gal4的AD则可与转录复合物中其他成分结合，激活UAS下游报告基因LacZ的转录。 酵母转录因子（Gal 4） 与BD-fusion 诱饵（bait） 与AD-fusion 猎物或靶蛋白（prey or target protein） 报告基因（reporter gene） Lac Z（编码β-半乳糖苷酶） 2 酵母双杂交系统的原理 AD Y AD Y X DNA-BD GAL4 UAS Promoter lacZ reporter gene transcription GAL4 UAS Promoter lacZ reporter gene GAL4 UAS Promoter lacZ reporter gene X DNA-BD X-Gal是β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的显色底物， 在β-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物，所以可以轻易的检测 出LacZ基因的表达。 表达“诱饵”和“猎物”蛋白； 检验这两种蛋白表达后能否激活酵母中的报告基因。 3 酵母双杂交系统的基本策略 4 酵母双杂交系统的优点 （1） 高敏感性 ①采用高拷贝和强启动子的表达载体，使融合蛋白过量表达； ②激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物，之后又与启动子结合，此三元复合体使融合蛋白各组分间结合更趋于稳定； ③通过mRNA使信号放大； ④检测的结果是基因表达产物的累积效应，可检测存在于蛋白质间的微弱或暂时的相互作用。 （2）真实性 检测在活细胞内进行，作用条件与作用力无需模拟，在一定程度上代表细胞内的真实情况。 （3）简洁性 融合蛋白相互作用后，减少了制备抗体和纯化蛋白质的繁琐步骤。 （4）广泛性 采用不同组织器官细胞类型和分化时期的材料构建cDNA文库，能分析不同亚细胞部位和功能的蛋白质，适用于部分细胞质、细胞核及膜结合蛋白。 分析已知蛋白之间的相互作用 对蛋白质功能域的分析，如可将待测蛋白质进行点突