05实验五DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳.pptVIP

1 2 3 4 ←RNA 提 示 将凝胶旋转180o，置于紫外灯下观察DNA电泳带型。 1 自提DNA 2λ-DNA / Hind III 3λ-DNA 结果记录与分析 绘制电泳图谱 λ-DNA / Hind III Markers λ-DNA / Hind III Markers 是利用EcoR I 彻底降解λ-DNA 后再进行内切酶的灭活处理和乙醇沉淀制备的。 贮藏缓冲液： 10mmol/L Tris-HCl (pH7.5), 10mol/L NaCl, 1mol/L EDTA λ-DNA / Hind III Markers片段大小（ bp）和电泳带型示意图 点样孔 23130 9416 6557 4361 2322 2027 知识回顾Knowledge Review 实验五DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳 限制性内切酶 EcoR I Restriction Enzyme 识别序列： ------G↓AATT C ------ ------ C TTAA↓G ------ BamH I Restriction Enzyme 识别序列： ------ G↓GATC C ------ ------ C CTAG↓G ------ Hind III Restriction Enzyme 识别序列： ------ A↓AGCT T ------ ------ T TCGA↓A ------ 每一种限制性内切酶都有特定的反应条件： pH范围： 7.5~8.0 缓冲液组份: Tris(三羟甲基氨基甲烷）、 NaCl、 MgCl2、 巯基试剂（巯基乙醇、二硫苏糖醇） 温育温度：37℃ 反应体系： DNA (1ug或更少) 5ul 10 x Buffer 2ul Restriction Enzyme 3ul H2O 10ul Total 20ul 混匀，37度保温30分钟 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是一种简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法。 电 泳 在一个电场的作用下，在某种支持介质上，能将一个混合物分离成若干条区带（若干个组分）的过程。 电泳法的优点 凡是能带电的物质，都可以用电泳法分离。 样品用量少。 设备简单。 可在室温进行。 操作简便，费时不多 不同类型的电泳，有不同的用途。 改进或找到更好的支持介质，就有可能大大地提高分辩率。 琼脂糖是一种线性多糖聚合物。将琼脂糖粉末加热到熔点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质。 琼脂糖 琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围 琼脂糖浓度(%) 线型DNA分子的分离范围(Kb) 0.3 5～60 0.6 1～20 0.7 0.8～10 0.9 0.5～7 1.2 0.9～6 1.5 0.2～3 12.0 0.1～2 试剂 TBE电泳缓冲液 45mmol/L Tris-硼酸，1mmol/L EDTA，pH 8.0 加样缓冲液 0.25%溴酚蓝，40%蔗糖 EB（溴化乙锭）染色液（有毒） 1ug /ml，用1×TBE配制 Blue / Orange 6 x Loading Dye 组成 10% Ficoll 400 0.25% bromophenol blue（深蓝色） 0.25% xylene cyanlo FF （天蓝色） 0.4% orange G （黄色） 10mol/L Tirs-HCl (pH7.5), 50mol/L EDTA 使用量 5份DNA溶液加1份Blue / Orange 6xLoading Dye 溴化乙锭(ethidium bromide，EB) EB是一种荧光染料，其扁平分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。 在电泳后，将凝胶浸入浓度为 0.5ug/ml的EB溶液中染色10～15min。琼脂糖凝胶经EB染色后，在紫外光照射下，可见核酸电泳带，DNA量一般5ng。 操作步骤 酶