0091第九章基因导入.pptxVIP

第九章 动物细胞基因工程（9.4） 第一节 基因转移的概念和生物学意义 第二节 基因导入的技术方法 第三节 外源基因表达的检测;第一节 基因转移的概念和生物学意义一、基因转移技术的种类二、受体细胞和基因导入方法的选择;第二节 基因导入的技术方法一、 微小细胞融合介导的基因转导二、 磷酸钙转染法三、 脂质体介导转染法四、 电击法五、 葡聚糖转染法六、 细胞显微注射转染法 ;第一节 基因转移的概念和生物学意义 把??源基因导入细胞中的技术称基因转移(Gene Transfer)或转基因技术。其主要意义在于： 1）检测基因的性状和功能。 2）产生特殊细胞组分或蛋白。 3）遗传病的诊断与治疗（动物模型）。 4）病变或癌变机理研究。 5）动物优良品种的培育（转基因动物）。 6）生物反应器制备。 ;一、基因转导技术的种类 基因转移可在染色体和DNA大分子两个水平上进行。染色体转导（chromosome transduction）是利用细胞融合或显微注射法把携有目的基因的染色体或染色体片段导入受体细胞(或称宿主细胞)内的技术。而基因转导（Gene transduction）或转染（transfection）是把已克隆的基因、含有目的基因的DNA片段或序列等，导入受体细胞基因组中的技术。; 基因转导的具体技术方法当前有：磷酸钙法、脂质体介导法、电击法和DEAE葡聚糖法等多种。; 从基因表达的持续性上可分为稳定表达(Stable or Permanent)和瞬时表达(transient 或短期表达)两类。 稳定表达是导入基因已被整合入受体细胞基因组中，从而能长期进行表达；对这类表达的检测，需借助筛选标记(Selected Marker)，才能测知。; 瞬时表达，在基因转移后一周内即可观察到基因表达现象，但不持久，随时间推移表达渐减弱或消失。瞬时表达的机理尚不清楚，可能与被导入的基因末进行整合有关。;细胞内转基因技术可归纳如下： 细胞融合技术 染色体转导 磷酸钙法 染色体注射 电击法  脂质体法 细胞内基因转导 显微注射法 基因转染 逆转录病毒介导法  （体细胞） 其他 基因转导  转基因动物 （生殖细胞）;二、受体细胞和基因转导方法的选择 受体细胞对导入后基因的表达有很大影响。基因导入后的表达与受体细胞性状、细胞种类、来源有密切关系。同一基因导入不同细胞，可能产生不同表达效果。; 细胞选择以β球蛋白基因为例；它是一种低水平表达基因，在Hela细胞中无表达；但如导入MEL—14(小鼠红白血癌细胞)细胞中，却能促MEL—14细胞发生分化。据此，检测β球蛋白基因时，需用MEL—14而不用Hela细胞。从而受体细胞的选择绝不是无关紧要的。; 在技术方法选择上，若目的在于获取瞬时表达效果，所有方法都可用。 稳定表达可选磷酸钙法、电击法和脂质体介导法，均有稳定转染效应。 ; 磷酸钙法和脂质体介导法利于被转染的DNA附在细胞表面，而后被细胞吞入，此两种方法适用于贴附生长细胞的转化。;第二节 技术与方法;一、微小细胞融合介导的基因转导(染色体导入)1.原理 用常规方法制备的高分子量DNA片段一般在50—80kb，因此用DNA转染法所转导的DNA片段长度受到限制。另外在DNA转染过程中，片段过长有可能人为地造成基因的损伤或异常改变等。因此是否能转移完整的DNA是一个十分重要的问题。; 应用微小细胞融合技术可将单个的、未受损伤的染色体从一种细胞转导到另一种细胞。应用这一技术得到的杂交细胞，是研究基因定位、哺乳动物基因结构、表达、调控的理想模型。;2.方法： 微小细胞融合介导基因转导技术所涉及到的主要实验方法和步骤较多，但主要为以下基本部分：①将选择性标志基因转导供体细胞；②制备微小细胞；③微小细胞与受体细胞融合；④杂交细胞筛选及鉴定。; [将选择标记基因