第三章液相色谱法.pptVIP

第三章高效液相色谱分析 一、高效液相色谱法 的特点 二、流程及主要部件 三、影响分离的因素 四、高效液相色谱法 的主要分离类型 液相色谱仪（1） 液相色谱仪（2） 液相色谱仪（3） 液相色谱仪（4） 第一节 概论 一、液相色谱理论发展简况 液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLC)。也称现代液相色谱。 二、高效液相色谱法的特点 高压-压力可达150~300Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。高速-流速为0.1~10.0 ml/min。高效-可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。高灵敏度-紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。 HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：速度快-通常分析一个样品在15~30 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。分辨率高-可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。灵敏度高-紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。柱子可反复使用-用一根色谱柱可分离不同的化合物。样品量少，容易回收-样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。 三、 高效液相色谱法的主要分离类型 高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。 1. 吸附色谱（液-固吸附色谱） 使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附－解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度5~10μm。适用于分离分子量200~1000的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。常用于分离同分异构体。流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。 2. 分配色谱（液-液分配色谱及化学键合相色谱） 使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。 ???流动相： HPLC分析中，为防止固定相的流失，流动相与固定液应尽量不互溶，或者说二者的极性相差越大越好。因此，根据流动相与固定相极性的差别程度，可将液液色谱分为正相分配色谱（流动相极性小于固定相极性，极性小的先流出，适于极性组分分离）和反相分配色谱（流动相极性大于固定相极性，极性大的先流出，适于非极性组分分离）。 ?? 正相色谱法：流动相的极性小于固定相的极性。　 ??? 采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相)；流动相为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。 反相色谱法 ??? 一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。 ??? 随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.5~7.5（2~8），太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在pH 1.5~10范围操作。 ????????????????????????????? 正相色谱法????????????????反相色谱法固定相极性???????????高～中?????????????????????? 中～低流动相极性????????????低～中?????????????????????? 中～高组分洗脱次序????????极性小先洗出??????????极性大先洗出 从上表可看出，当极性为中等