Roche 454(GS FLX Titanium System)超高通量测序技术原理.pdfVIP

Roche 454（GS FLX Titanium System）超高通量测序技术原理 2005 年底，454 公司推出了革命性的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统 ——Genome Sequencer 20 System ，被《Nature 》杂志以里程碑事件报道，开创了边合成边测序 （sequencing-by-synthesis ）的先河。之后，454 公司被罗氏诊断公司以 1.55 亿美元收购。2007 年，他们又推出了性能更优的第二代基因组测序系统—— Genome Sequencer FLX System (GS FLX) 。2008 年10 月，454 推出了全新的GS FLX Titanium系列试剂和软件，让GS FLX的通量一 下子提高了5 倍，准确性和读长也进一步提升。 想当年，GS 20 的出现，揭开了测序历史上崭新的一页。Jonathan Rothberg 博士就是大规模 并行测序的发明者，同时也是454 的创始人。上世纪90 年代，很多学者也都想到了大规模并行 测序，他们试图将Sanger 测序移到芯片上，但都以失败告终，因为这项技术没有可扩展性。1999 年，Rothberg 的儿子出世，他放了两个星期的陪产假。小家伙出生后被送入婴儿特护病房， Rothberg 非常担心，甚至想获取儿子的基因组信息。这段担惊受怕的经历给了他灵感，他突然意 识到焦磷酸测序（pyrosequencing ）不仅简单，而且具有可扩展性。两个星期之后，Rothberg 就 开始设计芯片和流动室，让测序在更小的反应室中进行，并同时进行几百万个反应。 硬件的设计和制造也只是成功的一半，在样品制备上还有同样漫长的路要走。Rothberg 摒弃 了传统的细菌克隆与挑选，将DNA 打断成随机片段，并寻找一种方法来克隆每个片段。受到其 他学者乳液实验的启发，他也想将DNA 放入油包水的乳液中，这样就省去了反应管。一个好汉 三个帮。在Joel Bader 等人的帮助下，Rothberg 验证了这些想法的可行性，并利用了炸药中的表 面活性剂来维持乳液的热稳定性。就这样，乳液PCR 终于诞生了。 对细菌的16S rDNA 的V6/V3 可变区进行测序分析，不需进行克隆筛选，测序的通量高，获 得的数据量大，周期短，能更加全面的反映微生物群体的物种组成，真实的物种分布及丰度信息。 GS FLX 测序原理 GS FLX 系统的测序原理和GS 20 一样，也是一种依靠生物发光进行DNA 序列分析的新技 术；在DNA 聚合酶，ATP 硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP 的聚合与一次荧光信号释放偶联起来 ( 图 1) 。通过检测荧光信号释放的有无和强度，就可以达 到实时测定DNA 序列的目的。此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳； 具有分析结果快速、准确、灵敏度高和自动化的特点。 Roche GS FLX System 是一种基于焦磷酸测序原理而建立起来的高通量基因组测序系统。在 测序时，使用了一种叫做“Pico TiterPlate” （PTP ）的平板，它含有160 多万个由光纤组成的孔， 孔中载有化学发光反应所需的各种酶和底物。测序开始时，放置在四个单独的试剂瓶里的四种碱 基，依照T、A 、C、G 的顺序依次循环进入PTP 板，每次只进入一个碱基。如果发生碱基配对， 就会释放一个焦磷酸。这个焦磷酸在各种酶的作用下，经过一个合成反应和一个化学发光反应， 最终将荧光素氧化成氧化荧光素，同时释放出光信号。此反应释放出的光信号实时被仪器配置的 高灵敏度CCD 捕获到。有一个碱基和测序模板进行配对，就会捕获到一分子的光信号；由此一 一对应，就可以准确、快速地确定待测模板的碱基序列。 图1：GS FLX 高通量测序方法原理示意图 GS FLX 系统的工作流程 GS FLX 系统的流程概括起来，就是“一个片段 = 一个磁珠 = 一条读长（One fragment = One bead = One read ）” 。 1）样品输入并片段化：GS FLX 系统支持各种不同来源的样品，包括基因组DNA 、PCR 产 物、BAC 、cDNA、小分子RNA 等等。大的样品例如基因组DNA 或者BAC 等被打断成300 － 800 bp 的片段；对于小分子的非编码RNA 或者P