总蛋白含量测定操作规程.docVIP

总蛋白含量测定操作规程 1 目的 确保口蹄疫灭活疫苗总蛋白含量测定（lowry）操作规程 2 范围 适用于口蹄疫灭活疫苗总蛋白量测定。 3 责任部门 QC部相关检验人员 4 内容 4.1 准备 4.1.1 设备?酶标仪(全波长)，“M”型96孔板，卡介苗注射器，单通道和多通道移液器，涡旋震荡仪，酶标板振荡器等。 4.1.2 试剂?丙酮(分析纯)、无菌去离子水、商品化Lowry法改良试剂盒 4.2操作步骤 4.2.1 标准系列稀释液制备?将商品化试剂盒内标准牛血清白蛋白(2mg/ml母液)，按下表依次稀释。 编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 母液(μl) 0 5 25 50 100 150 200 300 400 去离子水(μl) 400 395 375 350 300 250 200 100 0 终浓度(μg/ml) 0 25 125 250 500 750 1000 1500 2000 4.2.2 检验疫苗处理? 取1瓶疫苗（不少于100ml）恢复至室温摇匀后，在3个1.5 ml离心管中分别精确加入100μl疫苗和900μl丙酮，充分混匀，室温放置10分钟，在4℃条件下，以15000 g离心15分钟。吸弃液相，沉淀物用400μl丙酮洗涤2次，室温干燥约15分钟，加50μl去离子水复溶备用。 4.2.3 反应板加样与读数 4.2.3.1 各取2.1稀释的各浓度牛血清白蛋白标准溶液40μl，以及三重复待检疫苗样品40μl，分别加入到96孔板内。用排枪迅速加入200μl改良lowry法试剂盒内试剂，立即用振荡器混匀30秒; 4.2.3.2 封膜，室温孵育10分钟; 4.2.3.3 各孔内分别加入20μl 1倍酚试剂(试剂盒内为2倍，用前用去离子水现稀释)，立即用振荡器混匀30秒; 4.2.3.4 封膜，室温孵育30分钟; 4.2.3.5 酶标仪测定750nm吸光值，保存读数。 4.2.4 数据处理 根据系列标准蛋白稀释液的浓度(0μg/ml~2000μg/ml)和750nm吸光值，使用EXCEL以吸光值为X轴，以蛋白标准浓度为Y轴，绘制标准曲线，依据趋势线求得多项式，其多项式R2≥0.98。 4.2.5 结果判定 若测定结果为每毫升疫苗总蛋白含量小于或等于500μg，则判定被检疫苗总蛋白含量符合规定;若测定结果为每毫升疫苗总蛋白含量大于500μg，判定被检疫苗总蛋白含量不符合规定。 4.2.6 检测数据处理举例 4.2.6.1 收集数据如表所示 Value 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 0.102 0.149 0.336 0.504 0.836 1.122 1.334 1.702 1.923 -- -- -- B 0.677 1.722 0.252 1.116 2.167 1.020 -- -- -- -- -- -- C 0.640 1.704 0.230 1.050 2.195 0.962 -- -- -- -- -- -- D 0.641 1.716 0.225 1.061 2.175 1.012 -- -- -- -- -- -- E -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- F -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- G -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- H -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- 上述表格中，A1-A9为系列稀释的标准牛血清白蛋白溶液，A1至A9蛋白浓度依次增高;B、C、D行中1-6列为检测样品750nm吸光值，B1-B6为6批不同批次疫苗样品，每一列为同一疫苗样品三个重复。 4.2.6.2 绘制标准曲线:将上表中数据复制到EXCELL表格中， Value 1 2 3 4 5 6 7 8 9 OD750 0.102 0.149 0.336 0.504 0.836 1.122 1.334 1.702 1.923 蛋白浓度μg/ml 0 25 125 250 500 750 1000 1500 2000 采用EXCEL程序，选中1-9列对应的两行数据→插入→散点图，选择带平滑线和数据标记的散点图，得到以750nm吸光值为X轴，以蛋白浓度为Y轴的曲线图。选择图表工具中布局→ 趋势线→其他趋势线选项，选中多项式、显示公式和显示R平方值。通常R平方值大于等于0.98表明标准曲线可信。每一块96孔板应设一组标准并绘制相应标准曲线。 4.2.6.3 数值计算 以样品测定OD750值为X，代入y = 411.69x2+ 220.65x - 3.9423，Y为蛋白浓度，以表中第一批疫苗测定结果为例。该疫苗三重复测定