生化年的研究生实验2 PCR检测apoB基因多态性.pptVIP

（三） PCR反应条件 PCR循环的温度和时间（变性、退火、延伸） PCR循环的次数和平台效应 （1）变性温度：94-95℃ Templete：GC比例高、长度很长，则变性时间↑ （2）退火：温度越高，扩增特异性越好 取决于引物Tm值：Tm值=4(G+C) ＋2(A+T) ； 复性温度=Tm值-(5～10℃) ，一般在45～55℃ ； Tm↑退火T↑，Tm↓退火T↓ ； 若Tm较高，可使退火和延伸在同一温度 （3) 延伸：72 ℃ 1min/kb（10kb内） 一般：40－60sec 温度和时间 平台效应 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%， 但在实际反应中平均效率达不到理论值。 反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，引物、底物的消耗、 DNA聚合酶活性下降及非特异性产物的竟争等因素，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进 入线性增长期或静止期，即