第八章合子胚培养.docVIP

PAGE PAGE 14 第八章 合子胚培养 1合子胚培养的概念 1.1植物胚胎培养的概念 植物胚胎培养是指对植物的胚、子房、胚珠和胚乳进行离体培养，使其发育成完整植株的技术。目前，胚胎培养除了应用于育种工作外，还广泛被用来研究胚胎发生过程中的生理代谢变化以及有关影响胚发育的内外因素等问题。并且，在离体胚培养成功的基础上，又进行了胚乳、胚珠和子房的培养，特别是未受精胚珠或子房培养，为进行离体授粉(或试管受精)的研究提供了重要的技术条件。试管受精技术使克服远缘杂交中花粉与柱头之间的不亲和性成为可能。 1.2合子胚培养的概念 合子胚培养是指在无菌条件下分离和培养有性胚，以期获得可育植株的一种技术。1904年，Hannig最早在无菌条件下进行了离体胚培养实验，他当时所培养的是两种十字花科植物—辣根菜和萝卜的成熟胚。在含无机盐和蔗糖的半固体培养基上，Hannig成功将胚培育成可移栽的幼苗。随后，许多研究者从一些植物的成熟种子，特别是从败育导致种子不能萌发的植物中分离种胚，通过离体培养获得植株。依靠合子胚培养技术，现在已经能够挽救早熟败育的杂志胚了。 2胚培养的类型 离体胚培养可分为幼胚（未成熟胚）培养和成熟胚培养。离体培养中，这两类胚的成苗途径和所需营养条件也不太一样。 2.1成熟胚培养 由于成熟胚生长不依赖胚乳的贮藏营养，只要提供合适的生长条件及打破休眠，它就可在比较简单的培养基上萌发生长，形成幼苗。所以，培养基只需含无机盐和糖即可。另外，成熟胚培养技术也要求不严，将受精后的果实或种子(带种皮)用药剂进行表面消毒，剥取种胚接种于培养基上，在人工控制条件下即可发育成完整植株。 2.2幼胚（未成熟胚）培养 幼胚指的是尚未成熟即发育早期的胚。它较成熟胚难培养，要求的技术和条件也较高。幼胚培养时，可能有三种生长方式：一是继续进行正常的胚胎发育，维持胚性生长，最终形成具有萌发能力的成熟胚；二是不能维持胚性生长，迅速萌发为幼苗，这种未经完成正常的胚胎发育过程而形成幼苗的现象称为“早熟萌发”(precocious germination)。三是形成愈伤组织。由于早熟萌发形成的幼苗往往畸形瘦弱，甚至死亡。所以，进行幼胚培养时，关键是维持胚性生长。为了保证离体幼胚能沿着胚胎发生的途径发育，其对营养的需求较成熟胚复杂。另外，通过培养远缘杂交后的幼胚可获得远缘杂种。 3合子胚培养方法 3.1材料的选择与灭菌 由于植物类型及实验目的的不同，幼胚培养对材料的要求也不一样。如果是一般的实验或示范，最好是先用一种胚易于剥离的植物如大粒种子的豆科和十字花科植物；如希望培养材料的胚发育时期具有一致性，应选择开花和结实习性有规律的植物，如荠菜具有总状花序，各个胚珠处于不同的发育时期，一般沿花序轴由上而下，胚龄逐渐增加。每个蒴果含20～25个胚珠，且基本处于同一发育时期；如希望培养某一发育时期的胚，则须对刚开放的花进行人工授粉，并了解该植物授粉后的天数与胚胎发育的相应关系；如培养远缘杂种胚，则必须在其夭折前进行。 取回大田或温室里授粉受精后的植物子房，用70％的酒精进行几秒表面消毒，再用0.1％氯化汞灭菌10-30min，用无菌水冲洗3～4次，即可用于胚的分离和培养。 3.2胚的分离及培养 3.2.1 一般来说，在进行胚的离体培养时，必须把胚从周围的组织中剥离出来。成熟胚只须剖开种子即可剥离，比较容易。但有些种子种皮很硬，须先在水中浸泡之后才能剖开。在剥取比较小的胚的时候则须借助解剖镜，并且在剥离出来后，要立即转入培养瓶中。 对于幼胚的剥离，是把灭菌后的材料在无菌条件下切开子房壁，用镊子取出胚珠，剥离珠被，取出完整的幼胚，并置培养基上进行培养。由于植物的种类及发育时期的不同，幼胚分离的技术和难度也不一样(p160～161，荠菜和大麦的幼胚剥离)。 3.2. 对于成熟胚来说，由于其生长不依赖胚乳的贮藏营养，只要提供合适的生长条件及打破休眠，它就可在比较简单的培养基上萌发生长，形成幼苗。所以，培养基只需含无机盐和糖即可。另外，成熟胚培养技术也要求不严，将受精后的果实或种子(带种皮)用药剂进行表面消毒，剥取种胚接种于培养基上，在人工控制条件下即可发育成完整植株。 幼胚较成熟胚培养难，要求的技术和条件也较高。胚胎发育过程可分为两个时期：一为异养期(heterotrophy period)，即幼胚由胚乳及周围的组织提供养分；二为自养期(autotrophy period)，此时的胚已能在基本的无机盐和蔗糖培养基上生长。胚由异养转人自养是其发育的关键时期，这个时期出现的迟早因物种而异。在这两个时期之内，培养中的胚对外源营养的要求随胚龄的增加而逐渐趋向简单。 在人工培养基上幼龄胚通常很难培养，尽管对培养基做了不少改进，胚在发育的极早时期仍发生夭折，幼胚