新Y1H载体构建及转化步骤.docx

酵母单杂载体构建及实验流程（ZZY, 2016） 载体构建 1.转录因子连接到pB42AD上。 测序引物如下： pB42AD-2-F: GACTGGCTGAAATCGAATG pB42AD-2-R: CAACAACGTATCTACCAACGA 2.启动子连接到pLACZi2μ上。 测序引物如下： pLACZi2μ-F: ATGCTTCCTTCAGCACTACC pLACZi2μ-R: ATTTATGCTACAAAGGACCTAATG 3.所选酵母菌株：EGY48 转化步骤 酵母感受态细胞的制备： 1．酵母EGY48平板划线，活化，30℃ 培养 2-4 天。 2． 挑选直径在 2-3mm的酵母菌落，接种到3 ml YPD培养基中，30℃，225-250rpm，8-12h。 3． 在 250ml 烧瓶中加入 50ml 培养基，并加入 500ui-1ml 酵母菌液；30℃，225-250rpm，培养稀释过的菌液 18-24h； 4 检测 OD600 值， OD600=1.2 ，大于 1.2 时，加入培养基稀释重摇，小于 1.2 时，培养 1-2h 再检测，超过 24h 仍然小于 1.2 时，重新摇菌； 5 在 1L 的烧瓶中添加 300ml 培养基，然后吸取 50ml 的酵母菌液加入，30℃培养 3h，225-250rpm； 6 在 5000rpm 下离心 5min