原位杂交分析.docx

2.1.5.2 植物组织原位杂交分析（ 1） 植物材料的固定、包埋及切片、展片① 取新鲜番茄雄蕊，按不同发育时期投入标记好的装有 4%多聚甲醛固定液中（ 4%多聚甲醛、 0.1% Tween、 0.1% Triton， PH 7.0；）。固定液：材料 ≥ 20： 1。② 多聚甲醛有剧毒，应在通风厨中抽真空。抽真空直至材料沉没在固定液中。尽量缩短时间且尽量不要使液体过分沸腾，以材料沉入固定液中为准。③ 抽真空后更换一次新鲜的 4%多聚甲醛固定液， 4 ℃过夜。④ 将沉入固定液底部的材料移入 30%蔗糖溶液（ 1‰DEPC 水配置），处理过夜。⑤ 将沉入 30%蔗糖溶液底部的材料移入 30%蔗糖： OCT=1： 1 溶液处理 1 h。⑥ 将材料转入新鲜的纯 OCT，处理 2 h 以上（最好过夜），注意避免产生气泡。⑦ 用锡箔纸叠小船，倒入 OCT，将材料按所需方向摆好，放入-70℃，保存备用。⑧ 切片和展片。采用冷冻切片方法进行。由于冰冻切片温度低（ ~20℃），而载玻片温度高，因此只需将载玻片贴合在切片上方，即可将薄切片吸粘于载玻片上。切片前用 RNAstable 处理冷冻切片机内非有机部分，且刀片预先 180℃烘 5 h，毛刷用氯仿浸泡处理30 min，并在通风厨中吹风散味，锡箔纸包好备用。切片厚度为 8~10μm。（ 2） RNA 探针的地高辛标