原位杂交探针的制备.doc

原位杂交探针制备步骤 1. 转录模板的选取：选取目的基因中150-1200bp 长短的无ployA尾巴的非保守区段为模板。如果模板长度大于500bp, 杂交前需要将探针进行温和碱水解，小于500bp 探针杂交前则可不进行碱解。 2. 转录模板的制备：因为转录模板的纯度直接影响着探针合成的质量和数量，所以一般用质粒纯化试剂盒提取质粒。 首先，将模板DNA片断连接到 pGEM-T easy 克隆载体上, 转化大肠杆菌，经酶切或PCR鉴定甚至测序以后，挑取目的克隆（模板最好为反向连接，将来用T7转录酶合成anti－sense探针，用SP6转录酶合成sense探针。模板正向连接时用SP6转录酶合成anti－sense探针，用T7转录酶合成sense探针）于30ml LB液体培养基(含50mg/l Amp) 中 37℃, 200rpm 过夜（约16小时）。待菌液浓度约为5.0 A600 U/ml 时可以提取质粒。 3. 转录模板线性化： 先取少量的质粒溶液，用载体上的合适的多克隆位点的限制性内切酶进行酶切。限制性内切酶切断后必须为5突出或平端, 严禁采用3突出的限制性内切酶（如实在只能用3突出的限制性内切酶，则可在酶切后用T4 DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段在4种dNTP存在下消除3突出端）。 转录模板中应没有同样的酶切位点。载体上只有一个酶切位点。可用的限制性