第13章基因工程与PCR研究报告.pptVIP

* * 生物化学CAI课件A 第13章 基因工程与PCR 作者高新旺祁新芝 河南省周口卫校 目录 学习目标 PCR技术 复习题 重点内容：基因工程 基因工程 学 习 目 标 1.说出基因工程的操作步骤 2.列出基因工程的主要工具酶 3.简述PCR技术的工作原理 4.列出PCR的操作步骤 学时分配 第一节 2学时 第二节 1学时 第一节 基因工程 基因工程又称重组DNA技术，是对携带遗 传信息的分子进行设计和改造的分子工程，包 括基因重组、克隆和表达。基因工程与蛋白质 工程、酶工程和细胞工程共同构成了当代新兴 的学科领域—生物技术工程。 DNA克隆就是应用酶学的方法，在体外将各种来 源的遗传物质—同源的或异源的、原核的或真核的、 天然的或人工的DNA与载体DNA结合成一具有自我复 制能力的DNA分子—复制子(replicon)，继而通过转 化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细 胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子，既 DNA克隆。由于早期研究是从较的染色体分离、扩增 特异性基因，因此DNA克隆又称基因克隆(gene cloning)。 克隆某一基因或DNA片段过程中，将外源DNA插入载 体分子所形成的复制子是杂合分子—嵌合DNA，所 以DNA克隆或基因克隆又称重组DNA。 实现基因克隆所采用的方法及相关的工作统称重 组DNA技术，又称基因工程。 （二）工具酶 在重组DNA技术中，常需要一些工具酶进行基因操作。 1·限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶能识别特异的DNA序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA分子。限制性核酸内切酶存在于细菌体内，种类很多。目前发现的限制性核酸内切酶有1800种以上，常用的有几十种。现列举某些限制性核酸内切酶如下页表（其命名是根据含有该酶的微生物种属而定，如从淀粉液化芽孢杆菌H株分离出的第一种限制酶命名为Bam HⅠ）。 下表：限制性核酸内切酶 5…G GATCC…3 5…A GATCT…3 5…G AATTC…3 5…A AGCTT…3 5…G CGG…3 5… GATC…3 5…GA TATG…3 名 称 识别序列及切割位点 切割后产生5突出末端： BamHⅠ Bgl Ⅱ EcoRⅠ Hind Ⅲ Hpa Ⅱ Mbo Ⅰ Nde Ⅰ 续表：限制性核酸内切酶 名 称 识别序列及切割位点 切割后产生3突出末端： ApaⅠ HaeⅡ Kpn Ⅰ Pst Ⅰ Sph Ⅰ 切割后产生平末端： Alu Ⅰ EcorⅤ HaeⅢ Pvu Ⅱ Sma Ⅰ 5… GGGCC C …3 5… PuGCGC Py …3 5… GGTAC C …3 5… CTGCA G …3 5… GCATG C …3‘ 5…AG CT …3 5… GAT ATC …3 5… GG CC …3 5… CAG CTG …3 5… CCC GGG …3 2·DNA连接酶 DNA连接酶催化DNA分子中相邻的5‘磷酸基和3’羟基末段之间形成磷酸二酯键 ，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片连接。 3· DNA聚合酶Ⅰ 其作用是：①合成双链cDNA分子或片段连接 ②缺口平移制作高比活探针 ③ DNA序列分析 ④填补3′末端 4·Klenow片段 又名DNA聚合酶Ⅰ大片段，具有完整的DNA聚合酶Ⅰ的 5→ 3聚合、 3 → 5外切活性，。常用cDNA于的合成，双链DNA 3末端标记等 5·反转录酶 其作用是： ①合成cDNA ②替代DNA聚合酶Ⅰ进行填补、标记或DNA序列分析 6·多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化或 标记探针 7·末端转移酶 在3‘羟基末端进行同质多聚物加尾 8·碱性磷酸酶 切除末端磷酸基 （三）目的基因 应用重组DNA技术的目的是为获得某一感兴趣 的基因或DNA序列，或是为获得感兴趣基因的表达 产物—蛋白质。这些感兴趣的基因或DNA序列就是 目的基因，又称目的DNA。目的基因有两种类型， 即cDNA和基因组DNA。 cDNA是指经反转录合成的 与RNA（通常指mRNA或病毒RNA）互补的单链 DNA。以单链cDNA为模板经聚合反应可合成双链 cDNA。基因组DNA是指代表一个细胞或生物体整 套遗传信息（然色体及线粒体）的所有DNA序列。 目的基因又称外源DNA。