HCV非结构蛋白NS5A基因的斑马鱼肝脏表达模型.pdf

ChinMedBiotedmol，December2011，V01．6．No．6 437 中国医药生物技术2011年12月第6卷第6期 DOI：10．3969／cmba．j．issn．1673—713X．2011．06．010 ·论著· HCV非结构蛋白NS5A基因的 斑马鱼肝脏表达模型 赵晔，胡占英，佟军威，赵立勋，蒋建东，张靖溥 【摘要】 WHO统计，目前全世界约有1．7亿人感染HCV， 目的 建立HCV非结构蛋白NS5A基因在斑马鱼肝脏特每年约有300万一400万新增感染者13J。我国属 NS5A的体内作用机制并初步探 异表达的模型，研究HCV 于HCV感染的高发病区，感染率约为1．5％一 讨HCVNS5A对肝病理标志基因表达的影响。 方法 克隆肝基冈表达调控序列——斑马鱼脂肪酸结合蛋 染的防治仍缺乏有效的方法。目前临床用于治疗 HCV感染主要的方案是采用聚乙二醇干扰素联合 白基因增强子序列(eFABP)和HCV非结构蛋白基因 NS5A基利巴韦林，但这种治疗手段只针对不足半数的患者 NSSA序列，利用CMV启动子序列，构建HCV 因和报告基因绿色荧光蛋白基因eGFP在肝脏共表达的基起作用，治疗效果个体差异性较大，且具有反复 性|5-61。由于缺少稳定可靠的HCV感染细胞模型和 因构件pFC．5AiR。经细胞转染实验验证所建构件的报告基 因DsRed表达红色荧光蛋白后，将该基因构件线性化并经动物模型，人们对HCV致病机制、抗病毒药物筛 显微注射导入斑马鱼胚胎；通过荧光显微镜观察和整体原位 选和疫苗等方面的研究进程受到严重阻碍。现阶段 杂交技术对目的基因NSSA的表达进行定位，验证其肝脏 只有黑猩猩是公认的易感性强的HCV天然宿主 特异性表达。采用RT-PCR方法和westeITlblot方法对 模型，该模型能够用于HCV整个生命周期的研 HCVNSSA基冈的转录和翻译水平进行检测；并检测肝脏 究【『71，但是复杂的伦理问题及成本问题严重制约了 病理相关的标志基因的转录水平变化。 该模型的应用。人肝嵌合小鼠模型也被证实可以感 染HCVt81，然而，由于该模型操作复杂，重现性较 结果细胞转染实验证明基因构件pFC-5AiR的报告基因 差，不能大规模运用于科研和药效筛选。因此，开 DsRed能够在肝癌细胞Huh7中表达；斑马鱼胚胎注射该 发新型HCV小动物模型，成为HCV研究中亟待 基因构件后在肝脏能够观察到红色荧光蛋白基因DsRed的 解决的一个问题。 表达；RT-PCR和westernblot结果显示HCV基因NS5A 能够在斑马鱼体内正确表达；原位杂交结果进一步证明了 成功克隆至今，其分子生物学特性研究取得了很大 NS5A的表达集中在斑马鱼肝脏内。进一步RT-PCR检测 的发展。HCV病毒的基因组为一条线性单股正链 表明HCVNS5A在斑马鱼体内的表达可导致一些肝代谢 RNA，全长约为9600个核苷酸，包含57端非翻 和纤维化相关基因的上调，如Adiponectin、LDLR、Argsyn、 译区(5-nontranslation7一NTR)、一个约为 region，5 TGF-p和H