慢病毒介导的RNAi技术.docxVIP

慢病毒介导的RNAi技术 一、概述 慢病壽(Lentivirus)载体是以HIV-1 (人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起來的基因治疗载体。和 一?般的逆转录病毒载体不同，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。该载体可以将外源基因有效地 整合到宿主染色体匕从而达到持久性表达。并它町以冇效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿 瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，因此具有广阔的应用前景。 目両慢病毒被广泛地应用于RNAi的研究中。山于体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂 的，因而使其应用受到较大的限制。釆用事先在体外构建能够农达siRNA的载体，然后转入细胞内转录 siRNA的策略，不但对基因表达抑制效果不逊色于体外合成siRNA,而且稳定整合表达载体的细胞屮，可 以发挥长期阻断基因表达的作川。但上述两种方法，一是受到转染试剂转染效率的影响，在一些细胞内无 法有效敲低(Knockdown) —些基因；二是传统方法得到稳定细胞株通常需要挑取单克隆，进行克隆化， 这样费时费力。利用慢病毒介导的方法可以解决上述问题，这是因为慢病毒介导的RNAi具有下述优点： ?慢病壽儿乎可以感染所有种类的细胞，不存在某些细胞难以转染的问题。 ?慢病毒可以在细胞基因组上稳定整合表达siRNA的元件，siRNA表达效率比较均一，因此，无需 挑取单克隆。 ?慢病毒载体具有卩票罗痔素(Puromycin)抗性基因，Puromycin nJ以在2?3天内杀死细胞，只有整合 了病毒载体的细胞能够存活，这样缩短了得到稳定细胞株的吋间。 慢病壽表达载体小，是由RNA聚合酶III启动子來指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶III有明确 的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA聚合酶III遇到连续4个或5个T时，它 指导的转录就会停止，在转录产物3,端形成1?4个U。U6和Hl RNA启动了是两种RNA聚合酶III依赖的 启动子，其特点是启动子口身元素均位于转录区的上游，适合于表达?21nt RNA和?5Ont RNA茎坏结构 (stem loop)o在siRNA表达载体中，构成siRNA的止义与反义琏，可由各自的启动了分别转录，然后两 条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA),载体内的位于 RNA聚合酶III启动子和4?5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后可折叠成具有1?4个U 3 突 出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNAo慢病毒介导的RNAi和其它方法的比较见图1。 ?nnmnTnr rrrnnniiiiiiii 二、pLKO」载体 美国RNAi协作组(The RNAi Consortium)已经利用pLKO」载体骨架构建了针对15,000个人类基因 和 15,000 小鼠基因的 shRNA 库，详细信息见文献 Moffat et al., Cell 2006 Mar; 124(6): 1283-98? pLKO.l 是 --种复制缺陷型慢病毒载体，它可以宜接通过转染操作被导入细胞，作为常规RNAi载体使用，也可被包 装成慢病毒颗粒，然后感染细胞。一旦进入细胞，整合到基因组，便可以稳定表达shRNA和具有Puromycin 抗性，Puromycin筛选口J以杀死没冇稳定整合慢病毒载体的细胞，得到稳定整合的细胞系。图2, 3分别为 pLKO」载体的图谱和shRNA的示意图。 5ZLTR RRE —shRNA insert cP PT Amp R hPGK Puro R sin 3y LTR 图2. pLKO.1载体图a 元件 注释 5LTR RRE U6 shRNA insert cPPT hPGK Puro R sin 35 LTR Fl ori Amp R pUC ori 5长末端重复序列(long terminal repeat) Rev反应元件，介导转录本出核，从而被有效包装 人类U6启动子,RNA聚合酶HI可以识别,指导下游shRNA转录 小发卡RNA插入片断 Central polypurine tract,促进载体片断入核，提高整合效率 人类磷酸U-油激酚启动了，指导puromycin抗性基因的组成性表达 表达的蛋白使细胞具有puromycin抗性，方便选择 3,失活长末端重复序列 fl细菌复制起点 氨茉青霉素抗性基因 pUC细菌复制起点 GGCCxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxGAGCTCxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxAAAAABom nancriptionshRNAuu GGCCxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxGAGCTCxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxAAAAA Bom n