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DNA文库的构建;第一节 基因组文库的构建;;;限制性内切酶;;;4 基因组文库的质量标准;5 基因组DNA文库构建的程序 (噬菌体基因组文库的构建) ;大相对分子质量(high molecular weight,HMW)基因组DNA的提取方法 ;;;;;;;;基因组DNA文库;第二节 cDNA文库构建;;;;4 cDNA文库构建的步骤;cDNA文库的构建:;;4.1 细胞总RNA的提取和mRNA的分离;;;4.2 cDNA第一链的合成;;②随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis)
根据许多可能的序列,合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短片段(混合物),作为合成第一链cDNA的引物。
在应用这种混合引物的情况下,cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生,而不仅仅从3’-末端的oligo(dT)引物一处开始。;4.3 第二链cDNA的合成;①自身引导合成法
获得的单链cDNA3’端会形成发夹结构的能力,以此作为第二链合成的引物,在大肠杆菌聚合酶I Klenow或反转录酶的作用下,合成cDNA的第二链。
;;②置换合成法 ;RNase H :特异水解与DNA 杂交的RNA上的磷酸二酯键,产生带有3‘—OH和5’—P的产物;③引导合成法 ;④引物-衔接头法;5 全长cDNA文库 ( full length cDNA library );oligo(dG)引导合成全长dscDNA ;载体引导合成全长dscDNA ;置换法合成全长dscDNA ;6 基因组DNA文库与cDNA文库的比较;;基因组DNA文库;思考题:
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