研究蛋白质相互作用的技术平台2.ppt

膜酵母双杂交体系 二、免疫沉淀与质谱分析蛋白质相互作用 蛋白质相互作用的研究方法 蛋白质注释信息资源 蛋白质概况了解 / / / 蛋白质相互作用的网络图谱 蛋白质相互作用研究的方法 验证发现的相互作用 GST-pull down 免疫共沉淀 细胞内蛋白质共定位 荧光能量共振转移 双分子荧光互补分析技术 一、GST-pull down GST：谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione?S-transferase) GSH：谷胱甘肽(glutathione)? 琼脂糖球珠-GSH GSH GST-融合蛋白 A GST B GSH A GST B GSH GST GSH A GST 原核蛋白的表达及纯化 诱导表达 常规接种含有表达载体的BL21菌，37℃摇菌过夜。取500ul过夜菌，接种到含氨苄的50ml LB中，37℃摇菌2h。 取适当浓度ITPG（0.1-0.5 mM ），30 ℃诱导细菌表达目的蛋白，3-5h收菌。 留取1ml菌液，用SDS Loading Buffer煮沸，上样电泳，Coomassie Brilliant Blue R250染色2h，脱色1h，观察蛋白表达情况. 蛋白纯化 将细菌移入50ml离心管，4℃,5000rpm*5min，弃上清，取1ml预冷PBS的重悬细菌，洗涤三次。 超声裂解10s*5-10次，样品太浓则加1%Triton-100，4℃,12000g*10min,上清移入另一EP管。 取50ul 50% Glutathione Sepharose 4B珠子，即250ul预冷PBS洗涤3次，500g*5min，弃上清。 细菌裂解加入Glutathione Sepharose 4B中，室温轮转30min。 500g*5min，弃上清，250ul预冷PBS洗涤三次，500g*5min，弃上清。 NOTES ITPG诱导浓度根据不同的蛋白质有所改变，一般在0.1-1mm之间。 诱导表达宜低温度长时间 ，避免形成包涵体。 GST pull down 将耦合有GST-A的GSH-bead与含有His-B裂解液4℃轮转共孵育2~4h。 结合物4℃，500g×5min，洗三次，吸干后加10ul Loading Buffer，煮沸5min，Western Blot分析。 需要用GST蛋白做对照。 优点与缺点 优点：直接的检测蛋白质是否结合形成复合物。 缺点：原核蛋白缺少多种翻译后修饰。 二、免疫共沉淀—Co-IP（Co-Immunoprecipitation） 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。 如果用蛋白质x的抗体结合x，那么与x在体内结合的蛋白质y也能被抗体所捕获。 利用细菌蛋白质的“protein?A/G”特异性地结合到抗体FC片段的原理， 将protein?A/G预先结合在argarose?beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，分离复合物。 Y Y Y Y Y Y Binding Washing Binding Y Y Elution 免疫共沉淀实验流程 Harvest 细胞置冰上，PBS 1ml洗一次。 PBS 1ml刮下细胞，4℃，500g×5min，弃上清。 Lysis 100ul细胞裂解液重悬细胞，4℃轮转，约6rpm 90min。 Preclearing 裂解细胞于4℃，12000g×10min，取上清（如有必要，5ul定量，取等量蛋白沉淀）。 取20ul裂解液，加入5ul 5×SDSLoading Buffer，煮沸5min，－20℃保存作上样。 各取20ul protein G，用300ul裂解液4℃，12000g×20s洗三次。 将裂解细胞上清加入到预冷的珠子中，4℃轮转3小时。 Co-IP 预澄清产物10000g×30s，取上清，测定蛋白浓度，用裂解液将蛋白浓度稀释到10mg/ml， 加入2ug抗体，4℃轮转过夜（如果效果欠佳，可加入1ug二抗轮转1小时）。 取30ul protein G用400ul理解液颠倒混匀，4℃，10000g×30s洗三次。加入IP反应产物，4℃轮转3小时。 10000g×30s弃上清，加1ml裂解液，4℃轮转5min，10000g×30s，弃上清，洗涤2次。 WESTERN 吸取上清，加15ul 5×SDSLoading Buffer，煮沸5min，10000g*30s，取上清电泳，Western Blot检测。 实验的关键 抗体是否可用于做Co-IP。抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在IP反应。 采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100)。不能用高浓度的变性剂（