不同DNA提取试剂盒提取作物种子基因组DNA效果的比较.docVIP

PAGE PAGE 1 不同DNA提取试剂盒提取作物种子基因组DNA效果的比较 　　摘要：比较3种不同DNA提取试剂盒（宝生物、天根、LGC）在转基因产品检测中的应用效果，分别提取玉米、水稻和大豆种子的基因组DNA。结果表明，天根DNA提取试剂盒DP305更为适合从作物种子中提取基因组DNA进行转基因成分检测。 　　关键词：DNA提取试剂盒；基因组DNA；作物；比较 　　中图分类号：Q943.2文献标识码：A文章编号：0439-8114（2013）08-1956-03 　　随着转基因作物种类的增多和种植面积的增加[1]，转基因种子的应用越来越广泛。转基因技术在提高作物产量、改善作物品质、缓解粮食危机等方面作出了巨大贡献，然而其安全性方面的不确定因素也带来了转基因生物安全问题[2，3]。2001年发布实施了《农业转基因生物安全管理条例》，对农业转基因作物及其产品实行安全评价制度、生产许可制度、经营许可制度和产品标识制度[4，5]。因此，需要对作物种子进行转基因检测，而基因组DNA提取作为转基因检测中的关键步骤，需要稳定、重复性好、简便快捷的方法进行提取。基因组DNA提取的方法有很多[6-8]，目前广泛使用的是商业化的基因组DNA提取试剂盒[9]，常见的DNA提取试剂盒主要分为3类：离心柱型、无毒型（不使用酚氯仿）、磁珠型。 　　本研究使用常见的不同DNA提取试剂盒对玉米、水稻、大豆种子的基因组DNA提取效果进行比较，确定了适合转基因检测使用的DNA提取试剂盒。 　　1材料和方法 　　1.1材料 　　转基因玉米MON810、转基因水稻科丰6号、转基因大豆GTS40-3-2均为农业部发放的标准品。 　　1.2试剂与仪器 　　天根DP305DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，宝生物D9093DNA提取试剂盒购自沈阳联星生物技术公司，LGC41602DNA提取试剂盒购自北京昊诺斯科技有限公司，PCR反应试剂均购自宝生物工程（大连）有限公司。 　　5424型高速离心机购自德国Eppendorf公司，ND2000型DNA定量仪购自美国Thermo公司，C1000型PCR仪及GelDocXR+凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司，BG-600k核酸水平电泳系统购自北京百晶生物技术有限公司。 　　1.3方法 　　1.3.1转基因作物基因组DNA的提取使用3种DNA提取试剂盒分别提取转基因玉米MON810、转基因水稻科丰6号和转基因大豆GTS40-3-2的基因组DNA，操作方法具体见试剂盒说明书。测定其DNA浓度及OD260nm/OD280nm。DNA提取率（μg/g）=DNA浓度（ng/μL）×体积（μL）/取材量（g）[5]。 　　1.3.2PCR扩增验证通过扩增筛选因子CaMV35S启动子基因来检测3种DNA试剂盒提取的基因组DNA在转基因成分检测中的效果，试验重复3次。PCR扩增引物和扩增条件[10]见表1。 　　2结果与分析 　　2.13种DNA提取试剂盒提取基因组DNA的效果比较结果 　　3种DNA试剂盒所提取的DNA及相关结果见表2。从表2中可以看出，LGCDNA试剂盒提取率最高，成本最高；宝生物试剂盒提取率次之，提取时间也较长，成本也较高；天根试剂盒提取率最低，成本也最低。在操作过程中还发现，LGC试剂盒和宝生物试剂盒的操作步骤比较繁琐，天根试剂盒的操作最简便快捷。 　　3种DNA提取试剂盒提取的基因组DNA浓度和纯度比较见图1和图2。从图1中可以看出，无论是玉米、水稻还是大豆，LGC试剂盒提取的DNA浓度为最高，宝生物和天根试剂盒提取的玉米和水稻的DNA浓度比较接近，但提取的大豆DNA浓度有明显差异，天根试剂盒提取的较低。从图2中可以看出，就大豆而言，天根试剂盒提取DNA纯度最高，宝生物试剂盒提取的次之，LGC试剂盒提取的最低；就玉米而言，LGC试剂盒提取的DNA纯度最高，宝生物试剂盒提取DNA纯度次之，天根试剂盒提取的最低；就水稻而言，LGC试剂盒提取的DNA纯度最高，天根试剂盒提取DNA纯度次之，宝生物试剂盒提取的最低。 　　2.23种DNA试剂盒提取基因组DNA的PCR验证结果分析 　　使用3种DNA试剂盒分别提取的玉米、水稻、大豆种子的基因组DNA进行PCR反应，扩增CaMV35S启动子基因结果如图3。从图3中可以看出，在均取1μLDNA进行PCR反应的情况下，PCR反应扩增CaMV35S启动子来检测提取的DNA，宝生物和天根试剂盒的图谱较清晰，LGC试剂盒效果较差。 　　3小结与讨论 　　天根试剂盒采用的是离心柱法，DNA损耗量较大，但是对于日常检测提取的样品是足够使用的。由于其对样品需求量小、耗时短、操作简单、成本低、纯度好，在日常检测中应用较广。宝生物试剂盒在样品使用量上较大，水浴时间也较长