中药对细菌抑菌作用的体外实验方法学研究.docVIP

中药对细菌抑菌作用的体外实验方法学研究 实用检验医师杂志20l1年3月第3卷第1期ChineseJournatofClinicalPathologist,March20l1Vol-3,No.1 中药对细菌抑菌作用的体外实验方法学研究 陶庆春 作者单位:100029北京市,北京中医药大学第三附属医院检验科 当今社会科技飞速发展,医疗手段和药物层出不穷.自 青霉素发明以来感染性疾病得到了较好的控制,但是如今抗 生素的不规范使用,致使多重耐药细菌出现.虽然抗生素在 不断地更新换代,但还是不能完全控制由耐药性细菌所致的 疾病.再者新一代抗生素价格昂贵,增加了患者的经济负担. 中药在控制耐药性细菌感染方面具有其独特的优势,中药价 格较低,毒副作用小,且很少有耐药现象出现. 中药对细菌抑菌作用的体外实验方法有很多,现将几种 主要方法列举如下. 1中药煎剂直接体外抑菌法 这种方法应用最普遍,用此方法进行研究的药物也最 多,主要有:中型滇丁香浸膏,竹板,黄连,黄芩,连翘,射干, 防风,黄柏,败酱草,鱼腥草,大黄,千里光,封子,丹皮,白芍, 九节茶,夏枯草,厚朴,大青叶,蒲公英,金银花,连翘,地丁, 瓜蒌,龙胆草,蚤休,栀子,板蓝根,知母,秦艽,四季青,马齿 苋,生晒参,生葱,蒜,白薇,紫草,山豆根,苦参,芙蓉叶等. 直接体外抑菌法研究过的耐药性细菌(主要来源于临 床)有:肺炎链球菌,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistantStaphylococcuso2treus,MRSA),凝固酶阴性葡萄球 菌,大肠埃希菌,肺炎克雷伯菌等. 1.1稀释法 1.1.1肉汤稀释法 常量稀释法取无菌管12支,每管加入水解酪蛋白 肉汤2ml.在第1管中加入药物2m1混匀,连续倍比稀释至 第11管,并从第11管中吸取2ml弃去,第12管为不含药物 的生长对照.在每管内加入制备好的接种物各100Ixl,使得 每管最终菌液浓度为5x10CFU,mL,注意稀释菌液于15min 内完成.当生长对照管生长状况良好,同时确定接种物未被 污染后,肉眼观察药物最低浓度无细菌生长者,即为受试菌 的最小抑菌浓度(minimalinhibitoryconcentration,MIC)1.若 需要测定最小杀菌浓度(minimalbactericidalconcentration, MBC)则把无菌生长的试管中吸取0.1m1加到冷却至50℃的 MH琼脂混合倾注平板,将前述稀释的原接种液倒在平板上, 培养48—72h后计数菌落,即可得到抗菌药物的MBC. 李建志等闭采用常量稀释法研究7种中草药对金黄色葡 萄球菌(Staphylococcus~tureus,SA),肺炎链球菌,铜绿假单胞 菌,白色念珠菌等13种菌株的抑菌作用,结果表明7种中药 对各菌株生长均有不同程度的抑制作用. 微量稀释法方法同常量稀释法,先将药物作稀释, 再配制0.5麦氏浓度菌液,用蒸馏水或生理盐水稀释菌液,使 得最终菌液浓度为5x10CFU/mL,每孔含0.1ml.35℃培养 18h后借助比浊计判别是否有细菌生长.若需要测定MBC, 方法同常量稀释法. 尹洪萍等[31将10种中药药液用Luria—Bertani(LB)液体 培养基做对倍连续稀释成系列浓度,用微量加样器依次在微 孔板各孔内加入稀释药液和菌液各8Ol,设不加药对照.震 荡混匀,置于5%-8%CO孵箱,35℃培养18h后,借助比浊 计判别是否有细菌生长.分别从每孔取两接种环接种在MH 琼脂平板,依前法再次孵育18h后观察是否有细菌生长,记 录各中药的MIC,并计算MIC50及MIC的药物浓度,从而观 察各种中药对耐药性肺炎链球菌的抑菌作用.彭青等[41用微 量稀释法研究6种中药单体对MRSA的抗菌作用.结果表明 6种中药单体对MRSA有不同程度的抑制作用,其中大黄酸 抑菌作用最强. 1.1.2琼脂稀释法琼脂稀释法是将药物混匀于琼脂培养 基中,配制含不同浓度的药物平板,使用多点接种器接种细 菌,经孵育后观察细菌生长情况,以抑制细菌生长的琼脂平 板所含药物浓度测得MIC. 药液稀释:排列无菌试管1O支,于2-10支管中加无菌 蒸馏水10ml,取中药提取物20Ⅱd,于第1管中加入10ml, 第2管中加入10ml.于第2管混合后取出10ml,加入第3 管,再混合后取1Om1加入第4管,如此连续稀释至第9管取 出10ml弃掉,第10管的无菌蒸馏水作对照. 含药平板制备:将已溶化的无菌MH琼脂900ml,分装 于10瓶,每瓶9Om1,将第1管中10ml药物倒人含90ml培 养基的瓶中,混匀后倾注平板.第2管及以后的平板制备同 第1管,凝固后备用,整个制备过程均为无菌操作.经过称 重,计算出每组每ml培养基中提取物的干重量. 2?实崩检验医师杂志2