总RNA的提取原理.docVIP

1.原理及方法（异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法）TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。RNA降解新鲜细胞：如果试剂没有问题，且外源性污染也可以排除，那么降解几乎都来自裂解液的用量不足。如 果将裂解液直接加入培养皿中裂解细胞，一定要使裂解液能覆盖住细胞。 　　2. 新鲜组织：某些富含内源核酸酶的样品(如肝脏，胸腺等)，即使使用电动匀浆器匀浆也不能避免RNA的降解。更可靠的方法是：在液氮条件下将组织研碎，并且匀浆时使用更多裂解液。　　3. 冷冻样品：样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后移至-70℃冰箱保存。样品决不能未经液氮速冻而直接保存于-70℃冰箱中。冷冻样品，即使是冷冻细胞，如果不在液氮条件下研磨碎，而直接加入裂解液中匀浆，RNA也比新鲜样品更容易降解。样品在与裂解液充分接触前决不能出现融化，所以研磨用具必须预冷，在碾磨过程中要及时补充液氮。样品研碎后，在液氮刚刚挥发完时，将样品迅速转移到含裂解液的容器中，立即混匀匀浆。　　4. 外源RNA酶的污染：试剂，器械及实验环境中的RNA酶进入实验系统。　　5. 内源RNA酶的污染：抑制剂失效或者用量不够，实验样品过多；匀浆时温度过高。Q：OD260/OD280比值偏低　　A：　　1. 蛋白质污染：确保不要吸入中间层及有机相。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。如果所得RNA的OD260/OD280比值偏低，则用氯仿重新抽提一次，再沉淀，溶解。　　2.苯酚残留：确保不要吸入中间层及有机相。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。　　3.多糖或多酚的残留：一些特殊的组织和植物中，多糖、多酚含量较多，这些残留也会导致OD260/OD280比值偏低。因此，从这类材料中提取RNA时，需要注意多糖、多酚杂质的去除。　　4.设备限制：测定OD260及OD280数值时，要使OD260读数在0.1-0.5之间。此范围线性最好。用水稀释样品：测OD值时，对照及样品稀释液请使用10mM Tris，pH7.5。用水作为稀释液将导致比值偏低。　　　　Q：RNA提取得率低　　A：　　1. 该组织或者细胞中RNA含量偏低：不同细胞和组织中RNA的丰度不同，如肝脏，胰腺，心脏等是高丰度组织(总RNA含量2-4μg/mg)，脑，胚胎，肾脏，肺，胸腺，卵巢等是中丰度组织(总RNA含量0.05-2μg/mg)，膀胱，骨，脂肪等是低丰度组织(总RNA含量0.05μg/mg)。　　2. 组织起始量太少或者太多：样品量过少，则细胞组织中RNA含量较低；样品量过多则可能超过裂解液的裂解能力，裂解将不完全，从而导致RNA得率低。核糖体RNA(ribosomal RNA，rRNA)是组成核糖体的主要成分。核糖体是合成蛋白质的工厂。在大肠杆菌中，rRNA量占细胞总RNA量的75%-85%，而tRNA占15%，mRNA仅占3-5%。rRNA一般与核糖体蛋白质结合在一起，形成核糖体（ribosome），如果把rRNA从核糖体上除掉，核糖体的结构就会发生塌陷。原核生物的核糖体所含的rRNA有5S、16S及23S三种。S为沉降系数（sedimentation coefficient），当用超速离心测定一个粒子的沉淀速度时，此速度与粒子的大小直径成比例。5S含有120个核苷酸，16S含有1540个核苷酸，而23S含有2900个核苷酸。而真核生物有4种rRNA，它们分子大小分别是5S、5.8S、18S和28S，分别具有大约120、160、 1900和4700个核苷酸。