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实验六 酶联免疫吸附测定法 摘要：酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay简称ELISA）是在免疫酶技术 （immunoenzymatic techniques）的基础上发展起來的一种新型的免疫测定技术，具有操作简便、灵 敏性高等优点，是生物化学等领域检验的常规测定方法。木实验釆用ELISA |nj接竞争法对牛奶 中鼠抗氯霉素（CAP）进行了检测和分析。 关键词：酶联免疫吸附测定鼠抗氯霉素检测 60年代初期，Averameas及Ram等在不破坏酶的催化活性及免疫球蛋白的免疫活性或 蛋白质结构的前提下，利用特殊的交联剂将辣根过氧化物酶（HRP）与人血清白蛋白（HSA） 连接在一起，后来乂用酸性磷酸酯酶（AP）与抗体（Ab）结合，这些结合物统称为酶标记 物或酶结合物，被用于抗原或抗体的示踪、定位或定量测定，从此建立了免疫酶技术。1971年 瑞典的Engvall和荷兰的Van Wccman等人使抗体与澳化氧激活的纤维索结合或使抗体吸附于 聚苯乙烯试管上制成I舌I相免疫吸附剂（固相载体），再与免疫酚技术结合，建立了酚联免疫吸 附测定法，用于检测抗体或抗原。1974年Voller等用聚苯乙烯微量反应板作为吸附载体吸附 抗体（抗原），再与相应的酶标记物结合，使ELISA操作更力便，易重复，灵敏度可高达隔 （10-9g）至pg （10-12g）,并冃所需仪器设备简单，因而成为生物化学，临床医学检验的常规 测定方法0—，原则上ELISA可用丁检测一切抗原、抗体及半抗原，可以直接定量测定体液中 的町溶性抗原。在实际应用方血可作疾病的临床诊断、疾病监察、疾病普查、法医检查、兽医 及农业上的植物病害的诊断鉴定等。因此，它和生物化学、免疫学、微生物学、药理学、流行 病学及传染病学等方面密切相关。ELISA过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加 待测抗体（抗原），再加相应酶标记抗体（抗原），生成抗原（抗体）-待测抗体（抗原）-酶标记抗体的 复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的呈。 待测抗体（抗原）的定量与有色产生成正比。ELISA常用的测定方法主要有直接法和间接法两种: 直接法是酶标记抗体与待检测样木中固相抗原直接作用，加入底物后，显色（其颜色深浅与样本 中抗原虽成止比）；间接法是使已知抗原吸附在固和载体上，与待检测样本中的抗体作用，再加 入酶标记抗同种动物抗体的免疫球蛋白（二抗），使与特异抗原抗体复合物中的抗体作川，加入 酚底物，显色（颜色深浅与样本中抗体量成」E比）。ELISA有许多改良方法，如夹心法（sandwich ELISA）、双抗体夹心法（double-antibody sandwich technique） ＞竟争法、酶-抗酶法和均质法 （homogeneousELISA）、生物素-亲和素放人系统（biotina-vidin system, BAS） ELISA 及斑点- ELISA（dot-ELISA）等。常用方法人致可分为三类：（a）测定抗体的间接法；（b）测定抗原的双 抗体夹心法；（c）测定抗原的竞争法。前两种方法主要用于测定抗体和人分子抗原，适用于临床 诊断上，而竞争法是测定小分子抗原的方法，因而尤其适用丁?食品分析。竞争酶联免疫吸附分 析法乂可分为直接竞争法和间接竞争法。直接竞争法主要有三步：抗体吸附丁?固相载体，温育 后清洗一加入含有抗原的待测液及酶标记的抗原，温育后清洗一加入酶底物温育后显色，判断 结果。间接竞争法主要有四步：抗原吸附于固体载体，温育后淸洗一加入含有抗原的待测液和 抗体，温育后清洗一加入酚标记抗体，温育后清洗一加入酚底物温育后显色，判断结果。 影响ELISA测定结果的因素主要包括以下儿点： （1）抗原：在ELISA中，包被于固相载体表面的抗原或抗体的來源和制备方法对试验结 果都有影响。包被所用的抗原必须是可溶性的，而4要求是优质和稳定的制剂，纯度和免疫原 性要筒。如果不纯，由于抗原中所含杂质就会竞争固相载体上的有限位置，降低敏感性和 特异性。此外还应考虑到制备包被抗原不应破坏其免疫学活性。 （2） 固相载体：可溶性抗原或抗体吸附于固相载体而成为不溶形式，这是进行酶标记测 定的基木条件。许多物质可作为固相载体，如纤维素、交联右旋糖甘、琼脂糖珠、聚丙烯、 聚苯乙烯、聚乙烯及聚氯乙烯等等。但在ELISA中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反 应板及蜩料管。由于微暈反应板所用试剂量少，操作方便，适合于大规模应用。国产聚苯乙 烯微量反应板口前已大量应用于ELISA测定，并且获得了满意的结果。但每批微量反应板 对抗原或抗体蛋白质的吸附性能是有显著差别的。实验证明，吸附效果似乎与塑料的类型及 其表而性质有关。 （3） 非特杲性