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实验六小鼠脾细胞培养 【实验目的】 了解原代细胞培养的基本方法及操作过程。 学习细胞计数、营养液的配制等，初步掌握无菌操作方法。 【实验原理】 (―)细胞原代培养 原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织和器官，经体外培养后, 直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需 的组织(或器官)，经消化，分解成单个游离细胞，在人工培养下，使其不断的 牛长及繁殖。 细胞培养是一种操作繁琐而又要求I-分严谨的实验技术。要使细胞能在体外 长期生长，必须满足两个基本耍求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的 水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度, 注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。 (-)细胞死活鉴定 死活细胞的鉴定方法有很多种，常用的有染色法和仪器分析法。染色法是 常用的细胞死活鉴定方法，简便，易于操作。不同的死活细胞鉴定方法有各自不 同具体的反应机理，但无论采用何种办法，都是利用了死活细胞在生理机能和性 质上的差异。 染色法分化学染色法和荧光染色法，根据染色机理的不同，染料或使死细胞 着色，或使活细胞着色。死活细胞在生理机能和性质上的差异主要包扌4 死活细胞细胞膜通透性的羞异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起 保护和屏障作用，只允许物质选择性的通过；而细胞死亡Z后，细胞膜受损，通 透性增加。常用的以台盼蓝鉴别细胞死活的方法就是利用了这一性质。台盼蓝， 又称锥蓝，是一种阴离子型染料，不能透过完整的细胞膜。所以经台盼蓝染色后 只能使死细胞着色，而活细胞不被着色。甲基蓝有类似的染色机理。植物细胞的 质壁分离也可鉴定死活。 死活细胞在代谢上的差异：是采用美蓝染料鉴肚酵母细胞死活的依据。美蓝 是一种无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。由于活细胞中新陈代谢的作用， 使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化性变为无色的还原型，因 此美蓝染色后活的酵母细胞无色；而死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们的无 还原能力或还原能力极弱，使美蓝处于氧化态，从而被染成蓝色或淡蓝色。 除此Z外，还有一些细胞器的专有染料。如液泡系的专有染料中性红。中性 红是一种低毒性染料，可以使活细胞液泡着红色，而细胞质和细胞核不被着色； 死细胞的液泡不被着色或浅染，染料弥散于整个细胞中，细胞核和细胞质被染成 红色。有时侯为了增加染色效果可以将两种染料结合使用，如甲基蓝-中性红混 合染色法。 【实验器材】 剪子，棉球，75%酒精，移液枪，无菌操作台，正置光学显微镜，倒置光学显微 镜，解剖盘，滴管，离心管，离心机，注射器，Eppendorf管，培养皿，酒精 灯，塑料培养皿，载玻片，盖玻片，血细胞计数板等。 【实验材料】 小鼠1只，细胞培养液（含生长因子），Trypen Blue染液，PBS缓冲液 【实验步骤】 （-）细胞的原代培养 取材： 取小白鼠一只，采用断头法处死；清水洗小鼠并浸于75%酒精中灭菌3分 钟。取出转入超净洁净台内的解剖盘内，无菌操作打开腹腔。取出脾脏，去除其 周围的脂肪纟0.织，银起脾脏用PBS液自上而下冲洗1—2次。转入无菌玻璃培养 皿中，待用。 分离脾细胞： 用滴管先向上述无菌玻璃培养1111中滴入PBS液30滴 再用“L”型针头注 射器在皿中吸取PBS液0. 2ml,然后将其沿脾长轴方向注射入脾内（使脾脏膨胀 以利于细胞散开）。 用针尖在脾脏上扎眼，并用针头轻刮脾脏表面挤出脾细胞，用滴管 ■吸皿屮的PBS液冲脾脏并吹散刮出的脾细胞, 稍倾斜并静置1?2 ■ 吸皿屮的PBS液冲脾脏并吹散刮出的脾细胞, 稍倾斜并静置1?2分钟。 吸取上述静置后的脾细胞悬液上清部 1mm *lmm 事 eer 血球计数板 分放入Eppendorf菅，并使量至lml,以3000转/分离心1?2分钟。 3 ?培养脾细胞： 超净洁净台屮取塑料培养皿一个，用“枪(1ml) ”加入细胞培养液2ml, 并在皿盖上画上标记，待用。 取上述离心后的Eppendorf管，在超净洁净台内开盖弃去上清液，用“枪 (200 Ml) w吸取塑料皿中的培养液400ml加入弃去上清液的Eppendorf管中, 用枪头吹匀管底的脾细胞，然后吸取200ml脾细胞悬液接种于上述缈?料培养皿 中，混匀，然后放入37°C、5%C02培养箱中培养。 (-)细胞死活鉴定及计数 试剂配制：用生理盐水配成5%Tyrpen Blue染液，备用。 2?染色计数： 取0.5mL细胞悬浊液放入试管屮，加入1-2滴染液。混合。2-5min后将细胞 放在血细胞计数板上观察死活情况，注意不要有气泡产生，放大倍数为10xl0o 染色后活细胞不着色，死细胞显示蓝色。注意染色时间不能超过否则染 液将细胞毒杀。 计数： 在10x10倍的显微镜下观察,