蛋白质的纯化与鉴定-2p.ppt

* * * * 首先寻找能被该分子识别和可逆结合的生物专一性物质，称为配基。 其次把配基共价结合到层析介质（或称载体），使配基固定化。 最后把固定化配基填充在层析柱内，制成亲和层析柱。 * 配基可以是小分子物质：一些辅酶、辅基 大分子物质：酶、抗体 * 4 ac.ppt These definitions are the ones we try to use. Washing: removing loosely bound substances, typically before eluting the target. Re-equilibration: step when the gel is brought back to the original buffer composition, pH etc Regeneration: step where the gel is treated specially to remove some bound substance or to replace something removed, typically during the elution step. * * （1）? 纤维素 优点：来源丰富，可供偶联基团较多，偶联后基团又能突出在载体外 缺点：结构不均匀，使偶联上配基浓度不一 非专一吸附强 易受氧化生成醛基 （2）? 葡聚糖凝胶：经环氧氯丙烷交联，立体网格多糖类，物化性质稳定，可用强碱除去非特异吸附杂质。 琼脂糖凝胶：D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖相间结合的链状多糖，用于亲和层析为交联珠状凝胶。 PAG具较多酰胺基，可制得配基含量较高。适用于配体和亲和物之间亲和力较弱的系统。 避免在PH2-11以外的溶液中长期使用，防止胺基水解。 * 1、??? 配基的选择 需仔细研究大分子同配基之间作用的性质 1、??? 亲和势 是配基对互补分子亲和力大小的量值，也是制备高效亲和柱的重要参数，一般在10－4－10－8M之间。解离常数高则不易连接，但解离常数太低，又会洗脱困难，如生物素－抗生物素蛋白解离常数为1×10－15M，要用pH1.5的6M胍-HCl才能洗脱。 1、??? 配基浓度 对亲和势较低系统（KL≥10－4M），增加配基浓度有利于吸附。但配基浓度太高易使配基活性中心互相遮盖，吸附力下降。同时非特异吸附增加。当增加配基浓度有困难，而亲和势又较低时，可用增加亲和柱的长度来提高吸附效率。 配基浓度太高又可使洗脱困难。 推荐配基浓度为1－10微克分子配基/毫升凝胶，约2μmol/ml为最好。 配制加入量比要求偶联量大几十倍。蛋白类配基含量5－10mg/ml。 2、??? 配基偶联的位置 需选用合适的，不影响与大分子连接的部位。 3、??? 配基大小的选择 亲和柱制备首选大分子配基。 * KL越小，配体对大分子的亲和力越高，在亲和层析中就越有价值。 * 1、??? 载体的排斥效应 小孔经凝胶会明显阻止大分子物与配基结合 2、??? 载体的空间障碍 载体影响了配基的空间，特别是小分子配基。需加碳氢链“手臂”，长度需适中。 * 影响吸附的因素 缓冲液离子成份强度、pH、温度等都有影响。 流速尽可能慢，10ml/cm2.小时 上柱样品用平衡层析柱缓冲液溶解，浓度约20mg蛋白/ml. 上样体积取决于亲和势，低则上样量减少，一般柱床体积的5％。 * * Equilibrate the column and the sample to binding conditions. General starting point: equilibration buffer 50 mM sodium phosphate with 1-1.5 M ammonium sulphate Buffer choice will be discussed in more detail later 5 to 10 column volumes is normal for equilibration * Binding of the target protein ( and contaminants) Binding is promoted by moderately high concentrations of salt. A concentration of salt that gives an optimal purification is chosen. Some or most of the other proteins in the sample should not bind to the column a good bindi